タグー小分子プローブペアによるタンパク質複合体形成の可視化

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(1) CA6D4タグに対する「リアクティブタグシステム」の細胞機能解析への応用本年度は、これまで開発を進めてきたCA6D4タグを用いた「リアクティブタグシステム」を応用したブラジキン受容体やアセチルコリン受容体などの代表的なGタンパク質関連膜受容体(GPCR)の機能解析について検討を行った。結果として、CA6D4タグを導入して細胞発現させた膜受容体を蛍光プローブにより共有結合ラベル化後に、アゴニスト刺激に伴うインターナリゼーションの経時的な蛍光可視化や、インターナリゼーションする膜受容体を含むエンドソーム内部の酸性化の蛍光検出に成功した。また、エンドソーム内部のプロテアーゼ活性の上昇の蛍光検出への応用も行い、良好な結果を得つつある。これらの成果は、本研究において開発を進めてきた「リアクティブタグシステム」が細胞機能の解析に有用なツールとなる事を明確に示す結果である。(2) Hisタグに対する「リアクティブタグシステム」の細胞系バイオイメージングへの応用これまで開発を進めてきたHisタグに対する「リアクティブタグシステム」の細胞系での応用を目指して、Hisタグ配列の最適化およびプローブ構造の改良を進めた。様々な検討の結果、1) 反応性の高いシステイン残基のHisタグへの導入、2) プローブNi錯体部位のダイマー化によるHisタグとの親和性の向上、3) 反応部位をベンゼンフルフォン酸エステルからα-クロロアセチル基へ変更の三点の改善を行うことにより、HisタグモデルペプチドやHisタグ導入タンパク質を低濃度条件下において迅速にラベル化可能な反応システムへ改善する事に成功した。