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タグー小分子プローブペアによるタンパク質複合体形成の可視化

使用标签-小分子探针对可视化蛋白质复合物形成

基本信息

批准号：
20056014
负责人：
王子田彰夫
金额：
$ 2.82万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2008
资助国家：
日本
起止时间：
2008 至 2009
项目状态：
已结题

项目摘要

(1) CA6D4タグに対する「リアクティブタグシステム」の細胞機能解析への応用本年度は、これまで開発を進めてきたCA6D4タグを用いた「リアクティブタグシステム」を応用したブラジキン受容体やアセチルコリン受容体などの代表的なGタンパク質関連膜受容体(GPCR)の機能解析について検討を行った。結果として、CA6D4タグを導入して細胞発現させた膜受容体を蛍光プローブにより共有結合ラベル化後に、アゴニスト刺激に伴うインターナリゼーションの経時的な蛍光可視化や、インターナリゼーションする膜受容体を含むエンドソーム内部の酸性化の蛍光検出に成功した。また、エンドソーム内部のプロテアーゼ活性の上昇の蛍光検出への応用も行い、良好な結果を得つつある。これらの成果は、本研究において開発を進めてきた「リアクティブタグシステム」が細胞機能の解析に有用なツールとなる事を明確に示す結果である。(2) Hisタグに対する「リアクティブタグシステム」の細胞系バイオイメージングへの応用これまで開発を進めてきたHisタグに対する「リアクティブタグシステム」の細胞系での応用を目指して、Hisタグ配列の最適化およびプローブ構造の改良を進めた。様々な検討の結果、1) 反応性の高いシステイン残基のHisタグへの導入、2) プローブNi錯体部位のダイマー化によるHisタグとの親和性の向上、3) 反応部位をベンゼンフルフォン酸エステルからα-クロロアセチル基へ変更の三点の改善を行うことにより、HisタグモデルペプチドやHisタグ導入タンパク質を低濃度条件下において迅速にラベル化可能な反応システムへ改善する事に成功した。

(1)CA6D4 is currently developing its own research and application in the field of cell function analysis. CA6D4 is currently developing its own research and application in the field of cell function analysis. CA6D4 is currently developing its own research and application in the field of cell function analysis. CA6D4 is currently developing its own research and application in the field of cell function analysis. The results showed that CA6D4 was successfully introduced into the membrane receptor, and the membrane receptor was successfully acidified after co-integration and stimulation. For example, if you have a problem with the internal control system, you can increase the activity of the system, and if you have a problem with the internal control system, you can increase the activity of the system, and if you have a good result, you can increase the activity of the system. The results of this study are clearly shown in the following paragraphs: (2)The development and optimization of the cell line structure of His family for the cell line. The results of this study include: 1) the introduction of His group of highly reactive residues, 2) the upward affinity of His group of Ni group of residues, 3) the improvement of His group of residues in α-amino acids, 3) the improvement of His group of residues in Ni group of residues, 4) the improvement of His group of residues in α-amino acids, 5) the improvement of His group of residues in Ni group of residues, 6) the improvement of His group of residues in α-amino acids, 7) the improvement of His group of residues in α-amino acids, 9) the improvement of His group of residues in α-amino acids, 9) the improvement of α-amino acids, 9) the improvement of α-amino acids, 9) He was successful in introducing the substance into the medium at low concentrations, and in rapidly improving the possibility of reaction.