P型イオンポンプによる能動輪送機構の構造的解明

P型离子泵主动轮传输机构的结构解析

• 批准号: 14GS0308
• 负责人: 豊島 近
• 金额: $ 260.42万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Creative Scientific Research
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 2006
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-14GS0308/
• 关键词: 生物物理; 能動輸送; 膜蛋白質; イオンポンプ; X線結晶; ATPase; X線結晶解析

本研究の最大の目標は筋小胞体カルシウムポンプ(ATPase)の反応中間体を結晶化し、原子構造に基づいてポンプの作動機構を明らかにすることであった。分解能が十分でなかったE2・AlFx複合体の結晶性を改良し、反応過程ほぼ全体をカバーする6つの状態に関し2.6Åを越える分解能で構造を決定出来た。しかし、真のE2Pアナログの結晶であるE2・BeFxに関しては不満足なものしか得られていなかった。そこで、研究期間を延長し、強力阻害剤タプシガーギン存在下ではあるが、この状態に関しても2.4Å分解能で構造を決定でき、燐酸化アスパラギン酸の処理と膜内イオン通路の開閉がどう連携しているかをある程度明らかにすることが出来た。第2の柱である計算構造生物学では、特に心筋における調節蛋白として重要なフォスフォランバンの燐酸化による制御に関し徹底的な計算を行い、燐酸化の構造的意味を明らかにした。第3の柱である、発現系に関しては、筋小胞体カルシウムポンプを一残基改変することによって、抗マラリア薬に反応することが判明したので、大量生産・精製を行い結晶化可能な標品を得ることが出来た。また、重金属ポンプに関しては、好熱菌銅イオンポンプCopAに関し、蛋白質分解酵素による限定分解によって、蛋白質のトポロジーは大きく異なるにもかかわらず、カルシウムポンプと同様の構造変化を示すことを明らかにし、未知であったN端末金属結合ドメインの役割をも明らかにした。さらに、細胞質領域の2つのドメインと核酸複合体の高分解能結晶解析に成功した。このように、研究のすべての面で大きく前進した。

这项研究的主要目的是结晶肌质网钙泵（ATPase）的反应中间体，并根据原子结构阐明泵的驱动机理。 E2-ALFX络合物的结晶度不足，该复合物的分辨率不足，并通过六个覆盖整个反应过程的六个状态的分辨率超过2.6Å来确定结构。但是，我们只发现有关E2和BEFX的不满意的东西，这是真正的E2P类似物的结晶。因此，研究期限延长了，尽管存在强抑制剂thapsigargin，但可以以2.4Å的分辨率确定该条件的结构，从而可以阐明如何处理磷酸化的天冬氨酸以及对内膜内离子及其内部及其的开放和闭合。在第二个支柱的计算结构生物学中，我们对控制磷酸裂的控制进行了详尽的计算，这是一种调节蛋白，尤其是在心肌中，通过磷酸化，以阐明磷酸化的结构影响。关于第三个支柱，表达系统，发现通过修饰肌质网钙泵，它对抗疟药具有反应性，因此大量生产并纯化以获得具有结晶的标本。关于重金属泵，嗜热铜离子泵Copa表明，尽管由于蛋白酶的降解有限，蛋白质拓扑的差异很大，但蛋白质拓扑的降解量有显着差异，并且揭示了与钙泵相似的结构变化，从而揭示了N端金属结合结构域的未知作用。此外，成功进行了细胞质区域和核酸络合物中两个结构域的高分辨率晶体学。这在研究的各个方面取得了重大进展。

项目成果

Effects of inhibitors on luminal opening of Ca^<2+> binding sites in an E2P-like complex of sarcoplasmic reticulum Ca^<2+>-ATPase with Be^<2+>-fluoride.

抑制剂对肌浆网Ca^2-ATP酶与Be^2-氟化物的E2P样复合物中Ca^2结合位点的管腔开放的影响。

• 发表时间: 2006
• 期刊: J. Biol. Chem. 281
• 作者: S.Nakajima;D.Yokogawa;Y.Nakao;H.Sato;S.Sakaki;〓 剣萍;D. Kobayashi;Ryoichiro Suzuki;M. Picard
• 通讯作者: M. Picard

S.Hua: "Fe^<2+>-catalyzed oxidation and cleavage of sarcoplasmic reticulum ATPase reveals Mg^<2+> and Mg^<2+>-ATP site"Biochemistry. 41. 11405-11410 (2002)

S.Hua：“Fe^2-催化肌浆网ATP酶的氧化和裂解揭示了Mg^2和Mg^2-ATP位点”生物化学。

C.Toyoshima: "Structural changes in the calcium pump accompanying the dissociation of calcium"Nature. 418. 605-611 (2002)

C.Toyoshima：“钙泵的结构变化伴随着钙的解离”自然。

The average conformation at micromolar [Ca^<2+>] of Ca^<2+>-ATPase with bound nucleotide differs from that adopted with the transition state analog ADP.AIFx or with AMPPCP under crystallization conditions at millimolar [Ca^<2+>].

具有结合核苷酸的Ca ^ 2 -ATP酶在微摩尔[Ca ^ 2 >]下的平均构象不同于过渡态类似物ADP.AIFx或AMPPCP在毫摩尔[Ca ^ 2 >]结晶条件下采用的平均构象。

• 发表时间: 2005
• 期刊: J. Biol. Chem. 280
• 作者: M.Ehara;J.Hasegawa;H.Nakatsuji;T. Makino;K.Obara;G.C.Wang;S.Sakaki;Hyuck Joon Kwon;Kazutaka Takeda;Koichi Hasebe;M.Picard
• 通讯作者: M.Picard

S.Hua: "Functional role of "N" (Nucleotide) and "P" (Phosphorylation) domain interactions in the sarcoplasmic reticulum (SERCA) ATPase"Biochemistry. 41. 2264-2272 (2002)

S.Hua：“肌浆网 (SERCA) ATP 酶中“N”（核苷酸）和“P”（磷酸化）结构域相互作用的功能作用”生物化学。