Reconstitution and functional analyses of gliding machinery in Mycoplasma using minimal cell

使用最小细胞重建支原体滑动机制并进行功能分析

基本信息

批准号：
22KJ3181
负责人：
水谷雅希
金额：
$ 2.83万
依托单位：
National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2023
资助国家：
日本
起止时间：
2023-03-08 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22KJ3181/
关键词：
合成生物学ゲノムクローニング

项目摘要

今年度はMycoplasma mobile滑走運動に関わる遺伝子群のクローニングを主に行った。滑走運動に関わることが示唆されている７つのオペロンについて，繋げたい相手のオペロンの末端配列を持つプライマーを用いてPCR増幅し，Gibson assembly法を用いて連結し，大腸菌に形質転換した。コロニーを培養し，７つのオペロン間にある６つの繋ぎ目を標的としたマルチプレックスPCRによって連結の成否を確認した。その後，次世代シークエンス解析によって変異の確認を行ったところ，どのコンストラクトも恐らくPCRエラーに起因する数塩基の変異が見つかった。これと並行して，合成細菌JCVI-Syn3Bの低温適応化を行った。Mycoplasma mobileの成育至適温度は約25℃であるのに対し，JCVI-Syn3Bの成育至適温度は約37℃であるため，JCVI-Syn3Bでのタンパク質発現においてミスフォールディングが起こる可能性が危惧される。そこで実験室適応進化系を用いて本来培養不可能な25℃での培養が可能な進化型JCVI-Syn3Bを作製することに成功した。また，Mycoplasma mobileを基にした遺伝子操作法の開発も行っており，oriCプラスミドを設計し，形質転換を試みている。

今年，我们主要将涉及的基因涉及支原体移动滑行运动。使用具有终端序列的伴侣的操纵子的末端进行PCR扩增PCR，并使用Gibson组装方法进行了连接，并将其转换为大肠杆菌。通过针对七个操纵子之间的六个关节来确认菌落培养并结扎的成功或结扎失败。随后，通过下一代测序分析证实了突变，并且在所有构建体中发现了几个碱基的突变，这可能是由于PCR误差所致。与此同时，合成细菌JCVI-SYN3B适应低温。支原体移动的最佳生长温度约为25°C，而JCVI-SYN3B的最佳生长温度约为37°C，因此在JCVI-Syn3b中蛋白质表达可能会出现错误折叠的风险。因此，我们成功地创建了一个进化的JCVI-Syn3b，该JCVI-SYN3B可以在25°C下使用实验室适应进化系统进行培养，这通常是不可能的。我们还基于支原体移动而开发了基因工程方法，并正在设计oric质粒并试图改变它们。