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Reconstitution and functional analyses of gliding machinery in Mycoplasma using minimal cell

使用最小细胞重建支原体滑动机制并进行功能分析

基本信息

批准号：
22KJ3181
负责人：
水谷雅希
金额：
$ 2.83万
依托单位：
National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2023
资助国家：
日本
起止时间：
2023-03-08 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22KJ3181/
关键词：
合成生物学ゲノムクローニング

项目摘要

今年度はMycoplasma mobile滑走運動に関わる遺伝子群のクローニングを主に行った。滑走運動に関わることが示唆されている７つのオペロンについて，繋げたい相手のオペロンの末端配列を持つプライマーを用いてPCR増幅し，Gibson assembly法を用いて連結し，大腸菌に形質転換した。コロニーを培養し，７つのオペロン間にある６つの繋ぎ目を標的としたマルチプレックスPCRによって連結の成否を確認した。その後，次世代シークエンス解析によって変異の確認を行ったところ，どのコンストラクトも恐らくPCRエラーに起因する数塩基の変異が見つかった。これと並行して，合成細菌JCVI-Syn3Bの低温適応化を行った。Mycoplasma mobileの成育至適温度は約25℃であるのに対し，JCVI-Syn3Bの成育至適温度は約37℃であるため，JCVI-Syn3Bでのタンパク質発現においてミスフォールディングが起こる可能性が危惧される。そこで実験室適応進化系を用いて本来培養不可能な25℃での培養が可能な進化型JCVI-Syn3Bを作製することに成功した。また，Mycoplasma mobileを基にした遺伝子操作法の開発も行っており，oriCプラスミドを設計し，形質転換を試みている。

This year's Mycoplasma mobile skidding campaign is about to start. The slide movement is related to the selection of the seven elements, and the end of the selection of the two elements is arranged in the middle of the PCR amplification. The Gibson assembly method is used to link the seven elements, and the Escherichia coli is transformed. 7. Check whether the PCR link is successful or not. After that, the next generation of system analysis, identification of differences, identification of causes, identification of differences, identification of causes, identification of differences, identification of causes, identification of causes, identification of differences, identification of causes, identification of causes, identification, identification, identification, In parallel, the synthetic bacterium JCVI-Syn3B is capable of low temperature adaptation. The optimum temperature for the development of Mycoplasma mobile is about 25℃, while the optimum temperature for the development of JCVI-Syn 3B is about 37℃. The possibility of the development of Mycoplasma mobile is very high. The evolution of JCVI-Syn3B was successfully performed at 25℃. In addition, Mycoplasma mobile is based on the development of gene operation method, oriC software design, and physical transformation.