Reconstitution and functional analyses of gliding machinery in Mycoplasma using minimal cell

点击翻译按钮获取中文摘要

今年度はMycoplasma mobile滑走運動に関わる遺伝子群のクローニングを主に行った。滑走運動に関わることが示唆されている７つのオペロンについて，繋げたい相手のオペロンの末端配列を持つプライマーを用いてPCR増幅し，Gibson assembly法を用いて連結し，大腸菌に形質転換した。コロニーを培養し，７つのオペロン間にある６つの繋ぎ目を標的としたマルチプレックスPCRによって連結の成否を確認した。その後，次世代シークエンス解析によって変異の確認を行ったところ，どのコンストラクトも恐らくPCRエラーに起因する数塩基の変異が見つかった。これと並行して，合成細菌JCVI-Syn3Bの低温適応化を行った。Mycoplasma mobileの成育至適温度は約25℃であるのに対し，JCVI-Syn3Bの成育至適温度は約37℃であるため，JCVI-Syn3Bでのタンパク質発現においてミスフォールディングが起こる可能性が危惧される。そこで実験室適応進化系を用いて本来培養不可能な25℃での培養が可能な進化型JCVI-Syn3Bを作製することに成功した。また，Mycoplasma mobileを基にした遺伝子操作法の開発も行っており，oriCプラスミドを設計し，形質転換を試みている。