枯草菌tRNA中の微量修飾ヌクレオチドの探索とその化学構造の決定

1.tRNAの精製単離。存在量が微量なアミノ酸の画分についてカラムクロマトグラフィ-による精製を重ねた。その結果、Glu、Asp、Ileなどの遺伝コ-ドの少ないものも含めてほとんどすべてのアミノ酸について精製が終了した。例外として、アミノ酸受容活性測定が現時点では困難なTrp、Cysについてはその構造解析を待たなければどの成分が該当するのか確認できない。2.すでにDNAレベルで塩基配列の決定されているアミノ酸のtRNAについてはその配列の正しさが一部の例外を除いて確認できた。すなわち、主要な活性のセリンtRNAではエキストラル-プと呼ばれる部分にある-GGGGU-と報告されている配列が-GGGU-であることを確定した。また現在DNAでは配列が分かっていて微量修飾ヌクレオチドの存在が示唆されているIle(NAU)Leu(NAG)につて解析中である。3.HPLC/質量分析の条件設定。試料を高速液クロマトから直接導入するためには、多少の分離度の悪化を来たしても揮発性の緩衝液を利用しなければならない。また、ヌクレオシド、ヌクレオチドのイオン化の方式としてFAB法が最適であり、その助材となるマトリックス剤の検索も併せて行ったところ、酢酸アルキルアミン緩衝液、またマトリックスとしてはジェタノ-ルアミンが最適であった。4.微量修飾塩基の構造解析。初めに精製やヌクレオチド配列が決定できたセリンtRNAについて存在する修飾塩基の構造解析を行ったところ、予想されていた5-メトキシウリジン(mo^5U)、イソペンテニルアデノシン(i^6A)がそれぞれ分子イオンピ-ク、m/z273、m/z334に検出された。i^6Aはメチルチオ化されていなかった。さらに他のtRNAについても分析を引き続き行っていく予定である。

1.tRNAの精製単離。存在量が微量なアミノ酸の画分についてカラムクロマトグラフィ-による精製を重ねた。その結果、Glu、Asp、Ileなどの遺伝コ-ドの少ないものも含めてほとんどすべてのアミノ酸について精製が終了した。例外として、アミノ酸受容活性測定が現時点では困難なTrp、Cysについてはその構造解析を待たなければどの成分が該当するのか確認できない。2.すでにDNAレベルで塩基配列の決定されているアミノ酸のtRNAについてはその配列の正しさが一部の例外を除いて確認できた。すなわち、主要な活性のセリンtRNAではエキストラル-プと呼ばれる部分にある-GGGGU-と報告されている配列が-GGGU-であることを確定した。また現在DNAでは配列が分かっていて微量修飾ヌクレオチドの存在が示唆されているIle(NAU)Leu(NAG)につて解析中である。3.HPLC/質量分析の条件設定。試料を高速液クロマトから直接導入するためには、多少の分離度の悪化を来たしても揮発性の緩衝液を利用しなければならない。また、ヌクレオシド、ヌクレオチドのイオン化の方式としてFAB法が最適であり、その助材となるマトリックス剤の検索も併せて行ったところ、酢酸アルキルアミン緩衝液、またマトリックスとしてはジェタノ-ルアミンが最適であった。4.微量修飾塩基の構造解析。初めに精製やヌクレオチド配列が決定できたセリンtRNAについて存在する修飾塩基の構造解析を行ったところ、予想されていた5-メトキシウリジン(mo^5U)、イソペンテニルアデノシン(i^6A)がそれぞれ分子イオンピ-ク、m/z273、m/z334に検出された。i^6Aはメチルチオ化されていなかった。さらに他のtRNAについても分析を引き続き行っていく予定である。