Snyder libraryによる酵母の環境ストレス応答性遺伝子の単離と機能解析

使用 Snyder 文库分离酵母环境应激反应基因并进行功能分析

• 批准号: 08760081
• 负责人: 井上 善晴
• 金额: $ 0.7万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08760081/
• 关键词: Saccharomyces cerevisiae; ストレス; 過酸化脂質; 活性酵素; 環境

Snyder libraryは、プロモーターを欠失させた大腸菌由来のβ-ガラクトシダーゼ遺伝子(lacZ)と、Saccharomyces cerevisiae中での選択マーカーとしてのLEU2遺伝子が、S.cerevisiaeの染色体DNAを含むplasmid libraryにランダムに導入されたものである。このplasmid libraryからlacZ-LEU2を含む酵母の染色体DNA部分を切り出し、宿主酵母の染色体へ導入する。宿主酵母としては2倍体を用いる。その理由としては、lacZ-LEU2部分を宿主染色体へ導入した場合、その導入部分は相同組み換えにより置換破壊されるため、必須遺伝子であった場合、致死となってしまいその後の解析が不可能となるためである。今回、酸化的ストレス応答性遺伝子のクローニングの試みとして、過酸化脂質であるtert-ブチルヒドロペルオキシド(t-BHP)によって発現レベルが変化するクローンのスクリーニングを行った。約3000株のコロニーバンクをそれぞれ2枚のナイロン膜へ転写後、一方はそのまま最小培地へ移し、もう一方はt-BHP含有の最少培地へ移し28℃で培養しコロニーを形成させた。その後、ナイロン膜を液体窒素へ浸し室温で放置し細胞膜を凍結・融解により破壊した。その後ナイロン膜をX-galを含む緩衝液へ浸しコロニーの発色を観察した。その結果、t-BHPの有無によって青色の異なるクローンがいくつか得られた。得られたクローンを更に精査し、過酸化脂質に起因する活性酸素ストレスによって誘導的にβ-ガラクトシダーゼ活性が変化するクローンを3つを得た。1番目のクローンは四分子解析の結果、LEU2^+とβ-ガラクトシダーゼ活性はリンクして2:2分離を示した。2番目のクローンも2:2分離を示したが、3番目のクローンは調べたいくつかの胞子については発芽せず、致死性を示した。しかし、発芽可能であった胞子がLEU2^+でありβ-ガラクトシダーゼ活性を示したことから、3番目のクローンでは少くとも2ケ所でlacZ-LEU2断片の染色体への挿入が起こっていると考えられた。1番目のクローンでは、挿入部分をYIp5を用いてrescueし塩基配列を決定したところ2-デオキシグルコース-6ーリン酸ホスファターゼをコードするDOG2遺伝子内にlacZ-LEU2断片が挿入されていた。同様に、2番目と3番目のクローンについても挿入部位を特定したところ、両クローンとも酵母におけるレトロトランスポゾンであるTy1エレメントのうちのTyA遺伝子中に挿入されていた。これらのクローンのうち、DOG2遺伝子中に挿入されたクローンについて更に解析を行ったところ、DOG2-lacZ融合遺伝子の発現は、ジアミドやエタクリル酸などの細胞内グルタチオン枯渇剤やCd^<2+>によっても誘導された。

Snyder library contains the DNA of the LEU2 gene from Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, and the DNA of the chromosome of S.cerevisiae. The plasmid library contains lacZ-LEU2, which contains DNA from yeast chromosomes. host yeast diploid The reason is that the lacZ-LEU2 part of the host chromosome is introduced into the case, the introduced part is the same group, the substitution is broken, the necessary inheritance is broken, the lethal part is broken, and the analysis is impossible. In this paper, acidified lipids are used in the development of a wide range of reactive proteins, such as tert-side selection (t-BHP), hyperacidified lipids, and so on. About 3000 strains of BHP were cultured at 28 ℃ for 2 days, and one of them was cultured at 28℃ for 2 days. After that, the cell membrane is immersed in liquid and placed at room temperature to freeze and melt. The color of the film was detected by immersion in a buffer solution. The result of the test, t-BHP and whether there is a difference between the blue and the blue The results show that the activity of β-glucuronidase induced by hyperacidified lipids is closely related to the activity of β-glucuronidase. 1. The results of tetramolecular analysis of LEU2^+ and β- 2:2 separation, 3:3 separation, 3:3 separation, The activity of the β-glucokitsidranae in the spores of LEU2^+ and LEU2^+ is shown. The insertion of the lacZ-LEU2 fragment into the chromosome of LEU2 ^+ and LEU2 ^+ is shown in the 3-fold okrotrane. 1. The first part of the second part of In the same way, the second and third groups of the first and second groups of the first and third groups of the first and second groups of the first and third groups of the first and fourth groups of the first and third groups of the first and fourth groups of the first and third groups of the first and fourth groups of the first and third groups of the first and fourth groups of the first and fourth groups of the first and third groups of the first and fourth groups of the first and third groups of the first and fourth groups of the first and third groups of the first and fourth groups of the first and fourth groups of the first and third groups of the first and fourth groups of the first and fourth groups of the first and third groups of the first and fourth groups of the first and third groups of the first and fourth groups The discovery of the DOG2-lacZ fusion gene was induced by the intracellular ligand of jaimid and ekkalil acid and Cd^<2+>.