スレオニンアルドラーゼ遺伝子のクローニング、構造解析及び有機合成への応用

苏氨酸醛缩酶基因的克隆、结构分析及其在有机合成中的应用

• 批准号: 08760097
• 负责人: 劉 吉泉
• 金额: $ 0.7万
• 依托单位: Toyama Prefectural University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 1997
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08760097/
• 关键词: threonine aldolase; Site-directed mutagenesis; Aeromonas jandaei; cloning; threonine

スレオニンアルドラーゼは、グリシンとアルデヒドからβ-ヒドロキシ-α-アミノ酸を生成する反応、及びその逆反応を触媒する。β-ヒドロキシ-α-アミノ酸は、医薬品原料として有用であり、現在化学合成法により生産されている。しかし本方法では、立体特異性を制御できず、工業的製造の上での障害となっている。かかる背景下、スレオニンアルドラーゼを用いて、安価に供給されるグリシンとアルデヒドから、光学的に純粋なL-スレオ、L-エリスロ、D-スレオ、D-エリスローβ-ヒドロキシ-α-アミノ酸類を合成する方法の開発が望まれている。本研究では、この新規な合成方法の開発の一環として、Aeromonas jandaeiにより生産されるL-アロースレオニンアルドラーゼ遺伝子の取得・解析を行った.精製酵素のN-末端アミノ酸配列に基づいてプライマーを作成し、PCRにより約110bpの本酵素部分遺伝子の増幅を行った。本断片をプローブに用いてA.jandaei染色体DNAライブラリーとのコロニーハイブリダイゼーションを行い、L-アロースレオニンアルドラーゼ活性を有するクローンを単離した。一次構造解析の結果、本酵素は既知のPLP酵素との相同性は認められなかったが、Saccharomyces cerevisiae由来の機能未知のGLY1蛋白質及びCaenorhabditis elegans由来のGLY1-Like蛋白質とそれぞれ40%と41%の相同性を示した。本酵素においてPLP結合部位と推定された3つのリジン残基を各々アラニンに改変した結果、K199A改変酵素は420nmの吸収ピークを消失し、触媒活性も完全に失った。従って、K199基は本酵素の触媒反応においてPLPとシッフ塩基を形成して、アルドール反応を触媒すると推定された。

The catalyst for the formation of beta-and alpha-hydroxy acids is the catalyst for the formation of beta-and alpha-hydroxy acids.β-tert-butyl-α-tert-butyl acetate is a useful raw material for pharmaceutical products and is produced by chemical synthesis. The method has the advantages of high stereospecificity and high industrial production efficiency. In this context, the development of a method for the synthesis of L-trans, L-trans, D-trans, D-trans-β-trans-α-trans-acids in the optical, chemical, and synthetic fields is desired. This study is a part of the development of a new synthetic method for Aeromonas jandaei. The N-terminal amino acid sequence of the purified enzyme was amplified by PCR and the fragment of the enzyme was amplified by PCR. This fragment contains DNA fragments from A.jandaei and DNA fragments from A.jandaei and DNA fragments from A. jandaei. As a result of the first structural analysis, the enzyme showed 40% and 41% identity to the GLY1 protein of Saccharomyces cerevisiae origin and GLY1-Like protein of Caenorhabditis elegans origin. The enzyme was identified as a PLP binding site, and its catalytic activity was completely lost due to the disappearance of the 420nm absorption site of the K199A enzyme. K199 gene is a putative enzyme for the formation of PLP gene.

项目成果

Ji-Quan Liu: "L-allo-threonine aldolase from Aeromonas jandaei DK-39:gene cloning,nucleotide sequencing,and idetification of the pyridoxal 5'-phosphate binding lysine residue by site-directed mutagenesis" Journal of Bacterilogy. (in press). (1997)

Ji-Quan Liu：“来自金大气单胞菌 DK-39 的 L-别-苏氨酸醛缩酶：基因克隆、核苷酸测序以及通过定点诱变对吡哆醛 5-磷酸结合赖氨酸残基进行鉴定”《细菌学杂志》。