DNAビニルグラフト法による遺伝子の多点標識と超高感度分析

本研究の目的は、ビオチンを多数個導入した新規ポリマーの開発と、これをDNAへ導入した超高感度DNAプローブの開発である。今年度は、平成8年度に開発したビオチン型重合性モノマーを用い、新規ビオチンペンダント型ポリマー標識剤の合成を行ったところ、合成には成功したものの、ビオチン含有量及び、ポリマーの分子量に問題があり、高感度化の目的には不足であることが分かった。この原因は、ビオチン型ポリマーに含有する不純物が、反応性を下げたこと、および、末端ソラレン型ポリマーの重合条件では、得られるポリマーの分子量に限界があることが考えられた。そこで、まず、前年度開発した方法を基礎として、高純度のビオチン型重合性モノマーの合成法を確立した。また、検出時における標識アビジンとビオチンの結合効率を考慮して、重合基とビオチンユニットの間にアミノカプロン酸をリンカーアームとして挿入したビオチン型モノマーも新規開発した。これらのビオチン型モノマーは、純度が非常に高いものが得られたため、重合反応性は大幅に向上し、高濃度にビオチンを含むポリマーの合成が可能となった。次に、これを用いてポリビオチン型DNA結合性標識剤を開発するに当たっては、DNA結合分子としてソラレンを用い、高分子量のポリマーが得られるビオチンモノマー、アクリルアミド、ソラレン型モノマー共重合体を設計した。これに用いる重合性ソラレンモノマーも新たに合成した。実際に共重合により得られたポリマーは、電気泳動による検討から、充分なDNA標識能力があることが実証され、実用的DNAプローブ作成用の試薬を開発する事ができた。

本研究の目的は、ビオチンを多数個導入した新規ポリマーの開発と、これをDNAへ導入した超高感度DNAプローブの開発である。今年度は、平成8年度に開発したビオチン型重合性モノマーを用い、新規ビオチンペンダント型ポリマー標識剤の合成を行ったところ、合成には成功したものの、ビオチン含有量及び、ポリマーの分子量に問題があり、高感度化の目的には不足であることが分かった。この原因は、ビオチン型ポリマーに含有する不純物が、反応性を下げたこと、および、末端ソラレン型ポリマーの重合条件では、得られるポリマーの分子量に限界があることが考えられた。そこで、まず、前年度開発した方法を基礎として、高純度のビオチン型重合性モノマーの合成法を確立した。また、検出時における標識アビジンとビオチンの結合効率を考慮して、重合基とビオチンユニットの間にアミノカプロン酸をリンカーアームとして挿入したビオチン型モノマーも新規開発した。これらのビオチン型モノマーは、純度が非常に高いものが得られたため、重合反応性は大幅に向上し、高濃度にビオチンを含むポリマーの合成が可能となった。次に、これを用いてポリビオチン型DNA結合性標識剤を開発するに当たっては、DNA結合分子としてソラレンを用い、高分子量のポリマーが得られるビオチンモノマー、アクリルアミド、ソラレン型モノマー共重合体を設計した。これに用いる重合性ソラレンモノマーも新たに合成した。実際に共重合により得られたポリマーは、電気泳動による検討から、充分なDNA標識能力があることが実証され、実用的DNAプローブ作成用の試薬を開発する事ができた。