カリウムイオン依存的機能スイッチング能をもつ機能性核酸の創製と普遍的設計法の確立

具有钾离子依赖性功能转换能力的功能核酸的创建及通用设计方法的建立

• 批准号: 13J00927
• 负责人: 山置 佑大
• 金额: $ 1.54万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2013
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2013-04-01 至 2015-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13J00927/
• 关键词: グアニン四重鎖; リボザイム; RNAアプタマー; カリウムイオン; 分子設計

生体内におけるK+濃度は細胞外では約5 mM、細胞内では約100 mMであることが知られている。したがってK+濃度に応じて活性を切り替えることが可能な機能性核酸は自身が細胞内および細胞外のいずれに存在しているのかを感知し、存在場所に応じて自らの活性をスイッチングし得る。このような機能性核酸は医療用アプリケーションや様々な分子ツールへの応用が期待できる。これまでに我々はGGA繰り返し配列をもつRNA (R11)がK+存在下でコンパクトな四重鎖構造を形成することを見出し、この構造変化を利用してK+依存的にハンマーヘッド型リボザイムの活性をスイッチ可能な四重鎖リボザイム(QHR)を開発した。本年度はR11を用いてK+依存的に活性を制御する手法をリボザイム以外の機能性核酸へ拡張するためにHIVウイルスのTatタンパク質を捕捉するRNAアプタマーを2つのドメインに分割し、これらのドメインをR11の両末端にそれぞれ連結することで、四重鎖Tat捕捉アプタマー(QTAp)を開発した。QTApはK+非存在下ではTatの部分ペプチドを結合する活性を持たないが、K+存在下ではTatペプチドを結合する活性を発揮した。加えてQTApは細胞外に高濃度存在するNa+では活性化されずK+特異的に活性をスイッチできることを見出し、細胞内外における活性スイッチングに適した性質を持つことを示した。またNMR法を用いてQTApがK+濃度の増加に応じて四重鎖構造を形成しており、意図したとおりの設計に成功していることを示した。これらの結果から本手法がリボザイムのみではなく様々な機能性核酸へと拡張可能な汎用性の高い手法であることを示した。

In vivo, K+ concentration is about 5 mM outside the cell and about 100 mM inside the cell. K+ concentration, activity, detection, and detection of functional nucleic acids These functional nucleic acids are expected to be used in medical applications. Therefore, we have seen that the GGA RNA (R11) can form a four-fold lock structure in the presence of K+, and this structure can be transformed and utilized to develop a K+-dependent Hannemaid-type RAID (QHR) that enables the activity of a four-fold lock RAID (QHR). This year, the functional nucleic acid sequences other than the R11-dependent K+-dependent activity control strategy were released, and the Tat protein of HIV was captured. The RNA sequence was divided into two groups, and the terminal of R11 was linked. The quadruple lock Tat capture sequence (QTAp) was opened. QTAp is active in the absence of K+ and active in the presence of K+. The presence of Na+ in high concentrations outside the cell and the activity of K+ in the cell and the properties of K+ in the cell are shown. The NMR method was used to demonstrate the success of the design by increasing the concentration of K+ and forming a quadruple lock structure. The result is that the method is very simple, and the functional nucleic acid can be used widely.

项目成果

Creation of novel Tat-binding aptamer and ribozyme whose activities switch on in response to K+ via quadruplex formation

创建新型 Tat 结合适体和核酶，其活性通过四链体形成响应 K 值而开启

• 发表时间: 2014
• 作者: Y. Yamaoki;T. Mashima;T. Nagata;M. Katahira
• 通讯作者: M. Katahira

Boosting of activity enhancement of K+-responsive quadruplex hammerhead ribozyme

K反应性四链锤头核酶活性增强的促进

• DOI: 10.1039/c5cc00961h
• 发表时间: 2015
• 期刊: Chemical Communications
• 影响因子: 4.9
• 作者: Yudai Yamaoki;Tsukasa Mashima;Takashi Nagata and Masato Katahira
• 通讯作者: Takashi Nagata and Masato Katahira

Development of Tat binding aptamer and ribozyme which switch their activities in response to K+

开发 Tat 结合适体和核酶，可响应 K 改变其活性

• 发表时间: 2014
• 作者: Yudai Yamaoki;Tsukasa Mashima;Takashi Nagata;Masato Katahira
• 通讯作者: Masato Katahira

Development of quadruplex hammerhead ribozyme which switches on its ribozyme activity : introduction of a quadruplex-forming complementary DNA to repress a basal activity

开发可开启核酶活性的四链体锤头核酶：引入形成四链体的互补 DNA 来抑制基础活性

• 发表时间: 2013
• 作者: Yudai Yamaoki;Tsukasa Mashima;Takashi Nagata;Masato Katahira
• 通讯作者: Masato Katahira

Enhancement of a Quadruplex-ribozyme activity in response to K^+ : a quadruplex-forming complementary DNA enables accurate switching

响应 K^ 增强四链体核酶活性：形成四链体的互补 DNA 能够实现精确切换

• 发表时间: 2013
• 作者: Yudai Yamaoki;Tsukasa Mashima;Takashi Nagata;Masato Katahira
• 通讯作者: Masato Katahira