新規な３次元培養法によるヒトｉＰＳ細胞の肝分化誘導と臨床用人工肝臓装置への応用

新型三维培养方法诱导人iPS细胞肝分化及其在临床人工肝装置中的应用

• 批准号: 13J06641
• 负责人: 網本 直記
• 金额: $ 1.77万
• 依托单位: Kyushu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2013
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2013 至 2015-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13J06641/
• 关键词: 幹細胞; 肝細胞; 人工肝臓; バイオリアクター; 分化誘導--------

本研究では、中空糸/オルガノイド培養を用いたマウスES細胞の肝分化誘導過程において誘導される肝細胞の定量評価を行った。これまでに確立した肝分化誘導法を適用することで肝細胞への分化と肝機能発現は確認していたが分化誘導率は不明であった。そこで本検討では、成熟肝細胞マーカーとしてアルブミンを用いて、フローサイトメトリー解析を行うことにより、肝分化誘導率の定量評価を行った。その結果、肝細胞の出現時期・割合を明らかにした。また、マウス多能性幹細胞を用いた検討により確立した中空糸/オルガノイド培養法を用いた肝分化誘導法をヒトiPS細胞に適用し、ヒトiPS細胞の肝分化誘導に取り組んだ。マウス多能性幹細胞とヒト多能性幹細胞では、一部性質が異なるため、この点を踏まえてヒトiPS細胞の肝分化誘導条件の最適化を行った。特に、ヒトiPS細胞は単一分散化後の増殖能低下が著しい。そこで、まず、中空糸内部でヒトiPS細胞が良好に増殖可能な培養条件を検討した。単一分散後の細胞死を抑制する因子としてROCK (Rho-associated coiled-coil formlng kinase)阻害剤を添加した培養培地で培養・播種を行うことで細胞死を抑制し、ヒトiPS細胞の中空糸内培養が可能であることを見出した。次に、マウス多能性幹細胞を用いた検討で得られた知見を基に、肝分化誘導因子を添加し、肝分化誘導を行った。細胞密度変化、肝特異的遺伝子及び肝特異的機能の発現について解析を行った結果、分化誘導2週間目よりアンモニア除去能やアルブミン分泌能といった肝特異的機能の発現を確認した。また、その機能発現レベルは、ヒト初代肝細胞充填時の約1/2であった。以上の結果より、中空糸/オルガノイド培養を利用した多能性幹細胞の肝分化誘導法はバイオ人工肝臓開発の基盤技術として有望である。

This study で は, hollow si / オ ル ガ ノ イ ド cultivate を with い た マ ウ ス の liver ES cell differentiation during induction に お い て induced さ れ る の quantitative evaluation of liver cells 価 を line っ た. こ れ ま で に establish し た liver differentiation candidated を applicable す る こ と で hepatocellular へ の と liver function 発 は now confirmed し て い た が induction rate は unknown で あ っ た. Beg で そ こ で this 検 は, mature hepatocytes マ ー カ ー と し て ア ル ブ ミ ン を with い て, フ ロ ー サ イ ト メ ト リ ー parsing line を う こ と に よ り, の quantitative evaluation of liver differentiation inducing rate 価 を line っ た. Youdaoplaceholder0 そ result, period of appearance of hepatocyte <s:1> · cleidectomy を Ming ら に に た た. を ま た, マ ウ ス pluripotent stem cells with い た beg に 検 よ り establish し た hollow si / オ ル ガ ノ イ ド culture method を with い た liver differentiation candidated を ヒ ト iPS cells に し, ヒ ト の liver iPS cell differentiation induced に group take り ん だ. マ ウ ス pluripotent stem cells と ヒ ト pluripotent stem cells で は, a nature が different な る た め, こ の tread point を ま え て ヒ ト の liver iPS cell differentiation inducing conditions の line optimization を っ た. The <s:1> 単 and ヒトiPS cells have a low <s:1> proliferative capacity after dispersion が and are prone to に. そ こ で, ま ず, hollow si internal で ヒ ト iPS cells may な が に raised good colonization culture conditions を beg し 検 た. Youdaoplaceholder0 after dispersion, <s:1> cell death を inhibits する factor と <s:1> てROCK (Rho-associated coiled-coil for LNG) Kinase) resistance against tonic を add し た cultivation culture to で, sowing line を う こ と で cell death を し, ヒ ト iPS cells develop が within の hollow si may で あ る こ と を shows し た. を に, マ ウ ス pluripotent stem cells with い た beg で 検 must ら れ た knowledge を に, differentiation of liver induced factor を add し, liver induced を line っ た. Cell density variations, the traces of liver specific 伝 son and び liver specific functional の 発 now に つ い analytical line を っ て た results, induced differentiation between 2 weeks mesh よ り ア ン モ ニ ア can remove や ア ル ブ ミ ン can secrete と い っ た function of liver specific の 発 を now confirmed し た. The functions of また and そ are manifested in レベ そ and ヒト. When the primary hepatocytes are filled, <s:1> is approximately 1/2であった. の above results よ り, hollow si / オ ル ガ ノ イ ド cultivate を using し た の liver pluripotent stem cells differentiation candidated は バ イ オ artificial liver is crucial to open 発 の base plate technology と し て is expected to be で あ る.

项目成果

中空糸を利用した胚性幹細胞の大量培養法の開発

开发利用中空纤维的胚胎干细胞大量培养方法

• 发表时间: 2013
• 作者: 水本 博;網本 直記;永山 浩史;戸澗 一孔;梶原 稔尚
• 通讯作者: 梶原 稔尚

浮遊撹搾培養法によるES細胞の未分化維持培養に関する検討

悬浮振荡培养法ES细胞未分化维持培养的研究

• 发表时间: 2013
• 作者: 水本 博;導寺 香奈;網本 直記;梶原 稔尚
• 通讯作者: 梶原 稔尚

中空糸/オルガノイド培養法を利用したヒトiPS細胞の肝分化誘導

利用中空纤维/类器官培养法诱导人 iPS 细胞的肝分化

• 发表时间: 2013
• 作者: 網本 直記;堀田 義明;水本 博;中澤 浩二;井嶋 博之;船津 和守;梶原 稔尚
• 通讯作者: 梶原 稔尚

Fabrication of a functional hepatic tissue by stacking endothelial cell-covered hepatocyte spheroids

通过堆叠内皮细胞覆盖的肝细胞球体制造功能性肝组织

• 发表时间: 2013
• 作者: Tatsuya Okudaira;Naoki Amimoto;Hiroshi Mizumoto;Toshihisa Kajiwara
• 通讯作者: Toshihisa Kajiwara

Hepatic differentiation of ES cells inside hollow fibers

中空纤维内 ES 细胞的肝分化

• 发表时间: 2013
• 作者: Shinya Iwanaga;Ken Yamada;Yuka Shidahara;Naoki Amimoto;Hiroshi Mizumoto;Toshihisa Kajiwara
• 通讯作者: Toshihisa Kajiwara