未知・未培養微生物の検出・モニタリングを可能にする新規視覚的検出技術の開発

点击翻译按钮获取中文摘要

平成26年度は、平成25年度に開発を行った酵素を用いない新規高感度FISH法を純粋菌株及び環境微生物中のmRNAに適用させた。まず、標的mRNAを選定し、プローブの設計を行った。設計したプローブの適用可能性は、Clone-FISH法を用いて確認した。その結果、設計したプローブは、1塩基ミスマッチを識別できる高い特異性を有していることが明らかとなった。次に、標的mRNAを発現させた純粋菌株を用いて純粋菌株中のmRNAの視覚的検出を試みた。その結果、標的微生物から蛍光が確認できた。さらに、プローブを用いていない系、非標的微生物を用いた系からは蛍光が得られなかった。その結果から、標的微生物から得られた蛍光は、本手法のプローブ由来であると判断した。最後に、平成25年度で微生物群集を明らかにしたバイオリアクター内に生息する標的微生物のmRNAの視覚的検出を試みた。まず、スライド上で実験操作を行ったが、菌体数が少なく、また土壌等の不純物から非特異的な得られた。そこで、フィルター (pore size : 3.0 μm) を用いて不純物を除去し、フィルター (pore size : 0.2 μm) を用いて菌体の回収を行った。その結果、多くの菌体をフィルターに留めることに成功した。そのフィルターに対して本手法を適用させた結果、菌体以外から非特異的な蛍光があるのものの一部の菌体から蛍光が得られた。また、プローブを用いない系、交雑条件が厳しい実験条件では菌体から蛍光が得られなかった。これらの結果から、本研究で開発を行った本手法は微生物中のmRNAの視覚的検出技術として適用できることが明らかとなった。