時間窓を拡張した次世代型単分子in vivoイメージングの実現

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解析時間窓を飛躍的に拡張する蛍光標識技術の開発分～数時間オーダーの単分子イメージングの実現には、強い励起光照射下でも単分子由来の蛍光輝点が長期に亘って見られるようにする必要があるが、本研究では従来にないコンセプトでこれを実現する。すなわち、光退色により蛍光輝点が減っていっても、次々と新しい輝点が生ずるようにすることで、常にまばらに蛍光輝点がある状態を作り出すというコンセプトである。この新しいコンセプトを廣瀬が開発を進めてきたDeQODE法をベースとして実装する。DeQODE法は、標的蛋白質に融合させたタグ蛋白質（DeQODEタグ）に添加した色素が結合するとその蛍光が ONとなることで狙った蛋白質を蛍光標識する技術である。DeQODEタグと色素の結合は可逆的であるため、原理的には色素が退色しても、順次新しい色素と交換され、蛍光輝点がまばらな状態を長時間にわたって維持できると考えられる。今年度は、持続的に単分子イメージングに適した密度で明るい蛍光輝点が得られるように、DeQODEタグへの色素結合領域およびその近傍へ変異導入や、色素の誘導体化による構造展開により、結合・解離のキネティクスの最適化に取り組んだ。具体的には、DeQODEタグを細胞膜に発現させた培養細胞に種々の色素の融合体を添加した際にDeQODEタグとの結合・解離に伴って繰り返し現れる蛍光輝点の軌跡を解析した。ここで、加える色素の種類や濃度、DeQODEタグの変異体の種類の組み合わせを試し、長時間の単分子イメージングに適した条件を決定することができた。