霊長類モデルを用いた腸管化学感覚細胞の分子基盤と生体動態の解明

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腸管Tuft細胞は、受容体を介して寄生虫や微生物由来の腸内物質を化学的に認識し、分泌因子によって免疫細胞の活性化等を誘発することが、最近マウスを用いた研究で明らになった。一方で、ヒトを含む霊長類における腸管tuft細胞が同等の性質を有するかについては不明な点が多い。本研究では、ヒトに近縁な非ヒト霊長類を用いて、霊長類におけるTuft細胞の機能解明を目的とした。当該年度においては、まず、申請者らが報告した手法を用いてアカゲザル（Macaca mulatta）及びニホンザル（Macaca fuscata）の腸管組織から作製した腸管オルガノイドを培養し、同培養系に対して、CISPR-Cas9システム等を応用して遺伝子改変を行い、Tuft細胞特異的にレポーター遺伝子（蛍光物質・薬剤耐性遺伝子）を導入した新規解析系を樹立を行った。具体的には、Cas9タンパク質および標的遺伝子特異的gRNAを発現するCas9ベクター、レポーター遺伝子配列を含むノックインドナーベクターをそれぞれを設計し、エレクトロポレーション法を用いて細胞内に導入した。その後、薬剤選択培養によって遺伝子導入された細胞株を選別した。得られた薬剤耐性細胞株からゲノムDNA抽出し、それらを鋳型に遺伝子挿入領域をPCRおよびサンガーシーケンシングによって解析した結果、ターゲットゲノム領域に対する外来DNA配列の欠損のない挿入を確認した。ノックイン細胞株においてTuft細胞分化誘導培養を行った結果、オルガノイド中に蛍光物質陽性細胞の出現を確認した。またそれら陽性細胞がTuft細胞マーカー分子を共発現することを免疫蛍光染色によって確認した。したがって、マカク腸管オルガノイドにおいてTuft細胞を特異的に標識した新規遺伝子改変株の樹立に成功した。