直接電子移動型酵素の電子伝達に着目した生物電気化学的解析とその応用

直接电子转移酶中电子转移的生物电化学分析及其应用

• 批准号: 22KJ1996
• 负责人: 鈴木 洋平
• 金额: $ 1.6万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2023
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2023-03-08 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22KJ1996/
• 关键词: 酵素電極反応; 直接電子移動; 果糖脱水素酵素; 生物電気化学; 構造生物学; クライオ電子顕微鏡

本年度は，以下の2点に焦点を当て，果糖脱水素酵素（FDH）における直接電子移動（DET）型反応を詳細に解析した．（1）クライオ電子顕微鏡（cryo-EM）を活用したFDHの立体構造解明FDHは膜結合型タンパク質であるため結晶化が困難であり，X線結晶構造解析による立体構造決定が未達の状況であった．そこで，cryo-EM及び単粒子像解析を活用し，FDHの立体構造決定を試みた．本検討に関して，cryo-EMを保有する大阪大学生命機能研究科と連携した．解析の結果，FDHの立体構造を2.5 Åという高い分解能で決定することに成功した．立体構造より酵素内部に複数存在するコファクターの位置関係が明らかになり，酵素内電子移動を定量的に解析することが可能となった．また，構造情報に基づいて酵素表面の電荷分布を計算したところ，電極との電子授受を担う電極活性部位と示唆されているコファクター近傍が，局所的に負電荷になっていることが判明した．本知見に基づいて電気化学測定を実施すると電極の表面電荷に依存して反応特性が変化し，先行研究を支持する結果が得られた．（2）トリプトファンによるDET型反応促進作用の検証FDHの立体構造情報より，電極活性部位から酵素表面へと至る電子移動経路上に，トリプトファン及びフェニルアラニンが存在することが判明した．芳香族残基は，酵素内電子移動を促進する作用があることが知られているため，DET型反応の酵素―電極間電子移動においても，同様の機構が作用しているのではないかと考えた．そこで，これら2つの芳香族残基をそれぞれアラニンに置換した変異体を作製し，FDHのフルクトース酸化触媒反応に由来する電流―電圧曲線を記録したところ，トリプトファンを置換した変異体は特性が著しく低下していた．これらの電流―電圧曲線を速度論解析し，本特性の低下要因を定量的に評価することに成功した．

今年，我们专注于以下两个点，并详细分析了果糖脱氢酶（FDH）中的直接电子转移（DET）类型反应。 （1）使用冷冻电子显微镜（Cryo-EM）阐明FDH的三维结构，因为FDH是一种膜结合的蛋白，很难结晶，并且通过X射线晶体术分析确定了3维结构。因此，我们尝试使用冷冻EM和单粒子图像分析来确定FDH的三维结构。关于这项研究，我们与拥有Cryo-EM的大阪大学生活学院合作。分析导致确定FDH的三维结构，高分辨率为2.5Å。三维结构揭示了酶内存在的多个辅因子之间的位置关系，从而可以定量分析酶内的电子转移。此外，当基于结构信息计算酶表面上的电荷分布时，发现辅助因子被认为是负责电子传递和电极接收的主动电极位点，局部为局部电荷。当基于这一发现进行电化学测量时，反应特性根据电极的表面电荷而发生变化，从而导致支持先前研究的结果。 （2）验证来自FDH的3D信息的TheT型反应促进效应，发现色氨酸和苯丙氨酸存在于从活性电极位点到酶表面的电子转移路径中。由于已知芳族残基具有在酶内促进电子转移的作用，因此我们认为在酶和Det型反应中的酶和电极之间的电子转移中也可能发挥类似的机制。因此，我们创建了一个突变体，其中这两个芳香族残基被丙氨酸取代，并记录了从FDH的果糖氧化的催化反应得出的电流 - 电压曲线，并发现取代色氨酸的突变体具有明显较低的特征。我们通过分析这些电流 - 电压曲线的动力学来成功地定量评估了导致这种特征的因素。

项目成果

電気化学と構造生物学で解明する膜結合型フルクトース脱水素酵素の直接電子移動

通过电化学和结构生物学阐明膜结合果糖脱氢酶中的直接电子转移

• 发表时间: 2022
• 作者: Suzuki Yohei;Makino Fumiaki;Miyata Tomoko;Tanaka Hideaki;Namba Keiichi;Kano Kenji;Sowa Keisei;Kitazumi Yuki;Shirai Osamu;鈴木洋平，宋和慶盛，加納健司，北隅優希，白井理．
• 通讯作者: 鈴木洋平，宋和慶盛，加納健司，北隅優希，白井理．

フルクトース脱水素酵素のheme欠損変異体における直接電子移動とその反応機構に関する考察

果糖脱氢酶血红素缺陷突变体直接电子转移及其反应机制的探讨

• 发表时间: 2022
• 作者: Suzuki Yohei;Makino Fumiaki;Miyata Tomoko;Tanaka Hideaki;Namba Keiichi;Kano Kenji;Sowa Keisei;Kitazumi Yuki;Shirai Osamu;鈴木洋平，宋和慶盛，加納健司，北隅優希，白井理．;鈴木洋平，宋和慶盛，北隅優希，白井理．
• 通讯作者: 鈴木洋平，宋和慶盛，北隅優希，白井理．

Structural and Bioelectrochemical Elucidation of Direct Electron Transfer-type Membrane-bound Fructose Dehydrogenase

直接电子转移型膜结合果糖脱氢酶的结构和生物电化学阐明

• DOI: 10.26434/chemrxiv-2022-d7hl9
• 发表时间: 2022
• 期刊: ChemRxiv
• 作者: Suzuki Yohei;Makino Fumiaki;Miyata Tomoko;Tanaka Hideaki;Namba Keiichi;Kano Kenji;Sowa Keisei;Kitazumi Yuki;Shirai Osamu
• 通讯作者: Shirai Osamu

シトクロム欠損型フルクトース脱水素酵素の直接電子移動

细胞色素缺陷型果糖脱氢酶中的直接电子转移

• 发表时间: 2022
• 作者: Suzuki Yohei;Makino Fumiaki;Miyata Tomoko;Tanaka Hideaki;Namba Keiichi;Kano Kenji;Sowa Keisei;Kitazumi Yuki;Shirai Osamu;鈴木洋平，宋和慶盛，加納健司，北隅優希，白井理．;鈴木洋平，宋和慶盛，北隅優希，白井理．;鈴木洋平，宋和慶盛，北隅優希，白井理．
• 通讯作者: 鈴木洋平，宋和慶盛，北隅優希，白井理．