直接電子移動型酵素の電子伝達に着目した生物電気化学的解析とその応用

直接电子转移酶中电子转移的生物电化学分析及其应用

• 批准号: 22KJ1996
• 负责人: 鈴木 洋平
• 金额: $ 1.6万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2023
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2023-03-08 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22KJ1996/
• 关键词: 酵素電極反応; 直接電子移動; 果糖脱水素酵素; 生物電気化学; 構造生物学; クライオ電子顕微鏡

本年度は，以下の2点に焦点を当て，果糖脱水素酵素（FDH）における直接電子移動（DET）型反応を詳細に解析した．（1）クライオ電子顕微鏡（cryo-EM）を活用したFDHの立体構造解明FDHは膜結合型タンパク質であるため結晶化が困難であり，X線結晶構造解析による立体構造決定が未達の状況であった．そこで，cryo-EM及び単粒子像解析を活用し，FDHの立体構造決定を試みた．本検討に関して，cryo-EMを保有する大阪大学生命機能研究科と連携した．解析の結果，FDHの立体構造を2.5 Åという高い分解能で決定することに成功した．立体構造より酵素内部に複数存在するコファクターの位置関係が明らかになり，酵素内電子移動を定量的に解析することが可能となった．また，構造情報に基づいて酵素表面の電荷分布を計算したところ，電極との電子授受を担う電極活性部位と示唆されているコファクター近傍が，局所的に負電荷になっていることが判明した．本知見に基づいて電気化学測定を実施すると電極の表面電荷に依存して反応特性が変化し，先行研究を支持する結果が得られた．（2）トリプトファンによるDET型反応促進作用の検証FDHの立体構造情報より，電極活性部位から酵素表面へと至る電子移動経路上に，トリプトファン及びフェニルアラニンが存在することが判明した．芳香族残基は，酵素内電子移動を促進する作用があることが知られているため，DET型反応の酵素―電極間電子移動においても，同様の機構が作用しているのではないかと考えた．そこで，これら2つの芳香族残基をそれぞれアラニンに置換した変異体を作製し，FDHのフルクトース酸化触媒反応に由来する電流―電圧曲線を記録したところ，トリプトファンを置換した変異体は特性が著しく低下していた．これらの電流―電圧曲線を速度論解析し，本特性の低下要因を定量的に評価することに成功した．

This year, the following two points focus on fructose dehydratase (FDH) and direct electron transfer (DET)-type reaction. (1) X-ray crystal structure analysis is difficult to determine the three-dimensional structure of FDH by using cryo-EM. Cryo-EM and single-particle image analysis are used to determine the spatial structure of FDH. This paper discusses the relationship between cryo-EM and Osaka University. As a result of the analysis, the three-dimensional structure of FDH can be determined by 2.5 ° C high resolution energy. The spatial structure of the enzyme is complex, and the positional relationship between the enzyme and the electron movement in the enzyme is obvious. The structure information is used to calculate the charge distribution on the surface of the enzyme. The electron transfer of the electrode is used to determine the negative charge of the electrode. This paper describes the basic electrochemistry measurement of the electrode surface charge dependence and the change of the electrode reaction characteristics. (2) The steric structure information of FDH, which can be used to detect DET type reaction promotion, can be used to identify the existence of FDH in the electron movement path from enzyme surface to active site of electrode. Aromatic residues promote electron mobility within enzymes, DET enzymes promote electron mobility between electrodes, and the same mechanisms promote electron mobility. 2. Aromatic residues are replaced by heterogenics, and FDH is acidified. The analysis of current-voltage curve and velocity theory shows that the degradation of this characteristic is mainly due to quantitative evaluation.

项目成果

電気化学と構造生物学で解明する膜結合型フルクトース脱水素酵素の直接電子移動

通过电化学和结构生物学阐明膜结合果糖脱氢酶中的直接电子转移

• 发表时间: 2022
• 作者: Suzuki Yohei;Makino Fumiaki;Miyata Tomoko;Tanaka Hideaki;Namba Keiichi;Kano Kenji;Sowa Keisei;Kitazumi Yuki;Shirai Osamu;鈴木洋平，宋和慶盛，加納健司，北隅優希，白井理．
• 通讯作者: 鈴木洋平，宋和慶盛，加納健司，北隅優希，白井理．

フルクトース脱水素酵素のheme欠損変異体における直接電子移動とその反応機構に関する考察

果糖脱氢酶血红素缺陷突变体直接电子转移及其反应机制的探讨

• 发表时间: 2022
• 作者: Suzuki Yohei;Makino Fumiaki;Miyata Tomoko;Tanaka Hideaki;Namba Keiichi;Kano Kenji;Sowa Keisei;Kitazumi Yuki;Shirai Osamu;鈴木洋平，宋和慶盛，加納健司，北隅優希，白井理．;鈴木洋平，宋和慶盛，北隅優希，白井理．
• 通讯作者: 鈴木洋平，宋和慶盛，北隅優希，白井理．

Structural and Bioelectrochemical Elucidation of Direct Electron Transfer-type Membrane-bound Fructose Dehydrogenase

直接电子转移型膜结合果糖脱氢酶的结构和生物电化学阐明

• DOI: 10.26434/chemrxiv-2022-d7hl9
• 发表时间: 2022
• 期刊: ChemRxiv
• 作者: Suzuki Yohei;Makino Fumiaki;Miyata Tomoko;Tanaka Hideaki;Namba Keiichi;Kano Kenji;Sowa Keisei;Kitazumi Yuki;Shirai Osamu
• 通讯作者: Shirai Osamu

シトクロム欠損型フルクトース脱水素酵素の直接電子移動

细胞色素缺陷型果糖脱氢酶中的直接电子转移

• 发表时间: 2022
• 作者: Suzuki Yohei;Makino Fumiaki;Miyata Tomoko;Tanaka Hideaki;Namba Keiichi;Kano Kenji;Sowa Keisei;Kitazumi Yuki;Shirai Osamu;鈴木洋平，宋和慶盛，加納健司，北隅優希，白井理．;鈴木洋平，宋和慶盛，北隅優希，白井理．;鈴木洋平，宋和慶盛，北隅優希，白井理．
• 通讯作者: 鈴木洋平，宋和慶盛，北隅優希，白井理．