直接電子移動型酵素の電子伝達に着目した生物電気化学的解析とその応用

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本年度は，以下の2点に焦点を当て，果糖脱水素酵素（FDH）における直接電子移動（DET）型反応を詳細に解析した．（1）クライオ電子顕微鏡（cryo-EM）を活用したFDHの立体構造解明FDHは膜結合型タンパク質であるため結晶化が困難であり，X線結晶構造解析による立体構造決定が未達の状況であった．そこで，cryo-EM及び単粒子像解析を活用し，FDHの立体構造決定を試みた．本検討に関して，cryo-EMを保有する大阪大学生命機能研究科と連携した．解析の結果，FDHの立体構造を2.5 Åという高い分解能で決定することに成功した．立体構造より酵素内部に複数存在するコファクターの位置関係が明らかになり，酵素内電子移動を定量的に解析することが可能となった．また，構造情報に基づいて酵素表面の電荷分布を計算したところ，電極との電子授受を担う電極活性部位と示唆されているコファクター近傍が，局所的に負電荷になっていることが判明した．本知見に基づいて電気化学測定を実施すると電極の表面電荷に依存して反応特性が変化し，先行研究を支持する結果が得られた．（2）トリプトファンによるDET型反応促進作用の検証FDHの立体構造情報より，電極活性部位から酵素表面へと至る電子移動経路上に，トリプトファン及びフェニルアラニンが存在することが判明した．芳香族残基は，酵素内電子移動を促進する作用があることが知られているため，DET型反応の酵素―電極間電子移動においても，同様の機構が作用しているのではないかと考えた．そこで，これら2つの芳香族残基をそれぞれアラニンに置換した変異体を作製し，FDHのフルクトース酸化触媒反応に由来する電流―電圧曲線を記録したところ，トリプトファンを置換した変異体は特性が著しく低下していた．これらの電流―電圧曲線を速度論解析し，本特性の低下要因を定量的に評価することに成功した．