クライオ電子顕微鏡解析に基づく酵素―電極間直接電子移動制御型センサの開発

点击翻译按钮获取中文摘要

本研究は、汎用的な血中バイオマーカーの連続計測を可能とする酵素―電極間直接電子移動 (Direct Electron Transfer, DET) 制御型センサの開発を目的としている。具体的には、電極へのDET能を有するフラボシトクロムb2 (Fcb2)－シトクロム c (Cyt c) にそれぞれ抗体断片を融合させ、バイオマーカー依存的なDET効率の変化を測定原理とするセンサの開発を目指している。本年度は、主に1) Fcb2 とCyt cのクライオ電子顕微を用いた構造解析、と2) 構造情報に基づくFcb2 とCyt cへの抗体断片の融合、の観点から研究を進めた。1) Fcb2とCyt cのクライオ電子顕微鏡を用いた構造解析バイオマーカー依存的なDET効率の変化を測定原理とする新規センサの開発にはFcb2とCyt cの相互作用部位の特定が重要である。昨年に引き続き、それぞれ大腸菌発現系を用いて調製したFcb2とCyt cを量論的に混合させた後、クライオ電子顕微鏡解析を行った。結果、Fcb2の四量体構造を示す電顕像は得られたものの、Fcb2とCyt cの相互作用部位の特定には至らなかった。今後は、濃度比を変えて再測定する予定である。2) 構造情報に基づくFcb2 とCyt cへの抗体断片の融合クライオ電子顕微鏡を用いたFcb2 とCyt cの精密構造は得られていないが、既報の構造を基に、抗体断片を融合させるための連結モジュールの導入位置を決定した。それぞれ、連結モジュール融合分子を設計し、大腸菌発現系を用いて調製した。精製後の分子を用いて機能評価を行った結果、いずれも連結モジュール融合後もFcb2 とCyt cの本来の機能を保持していることが確認された。また、いずれも抗体断片との複合体化を行ったところ、高効率な複合体化、かつ抗体の機能を保持していることが確認された。