疾患特異的ヒトiPS細胞を用いた軸索輸送におけるoptineurinの役割の解明

点击翻译按钮获取中文摘要

本研究の目的は、筋萎縮性側索硬化症(ALS)の発症において重要と考えられている逆行性軸索輸送障害に及ぼす変異型optineurin(OPTN)の影響を解明することである。代表研究者は、逆行性軸索輸送に関与するモーター蛋白質であるdyneinがOPTNと相互作用する点に着目し、変異型optineurinが軸索での逆行性輸送障害を引き起こす可能性を考え、特にマイトファジー障害と生存シグナルの低下との関連性について検討を行う研究計画を立案した。令和4年度に実施した内容として、まず健常者由来iPS細胞株であるHPS4290を用いて、ダイレクトコンバージョン法による運動ニューロンへの分化を行った。脊髄運動ニューロンへの分化に必要な転写因子であるNeurogenin2、Islet-1、LIM-Homeobox3遺伝子をenhanced PiggyBacベクターを用いてエレクトロポレーションで導入し、Tet-On発現誘導システムを用いて分化誘導を行った。分化誘導終了後、軸索伸長が十分に得られた時点で脊髄運動ニューロンの分化マーカーであるChAT、Hb9 (MNX1)、Tuj1の発現を蛍光免疫染色で確認した。その後同様の手法でoptineurin変異(ミスセンス変異E478Gヘテロ接合およびナンセンス変異Q398*ホモ接合)を持つ患者由来iPS細胞3株を分化させて形態観察用チャンバーでの培養を行い、細胞体と軸索の分離を行って軸索観察を行うための実験系を確立した。今後はこの系を用いて、各株におけるOPTN、dyneinの軸索での発現と相互作用の有無を評価し、さらにミトコンドリア逆行性輸送および生存シグナル伝達に及ぼす影響を検証する予定である。