酢酸菌の制限酵素, 新しい酵素の開発とその分類学的側面

醋杆菌限制性内切酶、新酶的开发及其分类学方面

• 批准号: 62560098
• 负责人: 山田 雄三
• 金额: $ 0.9万
• 依托单位: Shizuoka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1987
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1987 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-62560098/
• 关键词: II型制限酵素; ApaLI; ApaORI; GceinI; GceGLI; Acetobacter pasteurianus; Gluconobacter cerinus; 酢酸菌

酢酸菌は組換えDNAの研究に有用な6塩基のパリンドロームを認識切断する多数の制限酵素を産生する. Acetobacter pasteurianus IFO13753の産生するII型制限酵素ApalIを本菌の無細胞抽出液よりストレプトマイシン処理, 硫安分画, ヘパリンーセファロースCL-6BおよびDEAE-セフアロースCL-6Bの各クロマトグラフィーおよびMonoQHR5/5を用いる高速液体クロマトグラフィーで, ポリアクリルアミド電気泳動的に単一にまで精製した. 精製酵素は入力NAを4か所で切断し, 24時間の酵素反応でも, その切断パターンに変化は見られなかった. 本酵素反応の至適条件は, 45°C, PH8.0, 7mMMgC1_2, 20mMNaClであった. しかし, NaClは0mMでも本酵素反応は充分に進行した. 本酵素の分子量はゲル濾過的に26,000, 等電点はアンホライン等電点電気泳動で4・8, クロマトフォーカシングで4.7であった. 本酵素の5分間のプレインキュベーションによる温度安定性では45°Cまで極めて安定であった. 本酵素のPH安定性は5.0〜8.0の間にあった. 本酵素はλ, Ad2, SV40, M13mp18RF, YbdintgX174RF, pBR322の各DNAを, それぞれ, 4, >6, 0, 1, 1, 3か所で切断した. YbdintgX-174RFDNAを本酵素で切断1, 5′末端を^<32>Pでラベルした後, Maxam-Gil-bert法で末端付近の塩基配列を決定した. その結果, 本酵素はDNAの塩基配列, 5′-GTGCAC-3′を特異的に認識し, そのGとTの間で切断する全く新しいII型制限酵素であることが解った. 本研究は他に, Acetobacter pasteurianus IFO13752のApa ORI, Gluconobacter cerinus IFO3260のGce inI, Gluconobacter cerinus IFO3285のGceGLIの各II型制限酵素を電気泳動的に単一にまで精製し, それらのDNA上における認識塩基配列およびその切断部位を決定した.

Boggy acid bacteria は group in え の DNA studies に useful な 6 salt base の パ リ ン ド ロ ー ム を know cut す る most limitations の enzyme を produce す る. Acetobacter pasteurianus The limitations IFO13753 の produce す る type II enzymes ApalI を this bacterium の cell free extract よ り ス ト レ プ ト マ イ シ ン 処, sulfur content, ヘ パ リ ン ー セ フ ァ ロ ー ス CL - 6 b お よ び DEAE - セ フ ア ロ ー ス CL - 6 b の each ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー お よ び MonoQHR5/5 を い る high-speed liquid ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー で, ポ リ ア ク リ ル ア ミ ド electric 気 swimming に 単 a に ま で refined し た. Refined enzyme は NA into force を 4 か で cut し, 24 time の enzyme reverse 応 で も, そ の cut パ タ ー ン に variations change は see ら れ な か っ た. This enzyme reverse 応 は の to optimum conditions, 45 ° C, PH8.0, 7 mmmgc1_2, 20 mmnacl で あ っ た. し か し, NaCl は 0 mm で も this enzyme reverse 応 は に to adequately し た. This enzyme の molecular weight は ゲ ル filtration に 26000, isoelectric point は ア ン ホ ラ イ ン isoelectric point electric 気 swimming で 4, 8, ク ロ マ ト フ ォ ー カ シ ン グ で 4.7 で あ っ た. This enzyme has a <s:1> 5-minute <s:1> プレ キュベ キュベ キュベ ショ ショ による による による temperature stability で at 45°Cまで extremely めて stable であった. The <s:1> PH stability of this enzyme is between <s:1> 5.0 and 8.0 <s:1> and にあった. Each DNA of this enzyme にあった λ, Ad2, SV40, M13mp18RF, YbdintgX174RF, pBR322 を, それぞれ, 4, >6, 0, 1, 1 3 か で cut し た. YbdintgX - 174 rfdna を this enzyme で cut 1, 5 'end を ^ < > 32 P で ラ ベ ル し た, Maxam - Gil - Bert method で end paying nearly の salt base with column を decided し た. そ の as a result, the enzyme は DNA の salt base with columns, 3 '5' - GTGCAC - を know specific に し, そ の G と で cut between T の す る く all new し い limitations type II enzymes で あ る こ と が solution っ た. This study に he, Acetobacter pasteurianus IFO13752, Apa ORI, Gluconobacter cerinus IFO3260, Gce inI Gluconobacter cerinus IFO3285 GceGLI <s:1> each type II limiting enzyme を electrokinetic に単 - にまで refining <e:1>, それら <s:1> DNA における recognizing the coordination of the base およびそ cutting site を determines the た.

项目成果

Y. Yamada: Agricultural and Biological Chemistry. 52. (1988)

Y. Yamada：农业和生物化学。

Y. Yamada: Journal of General and Applied Microbiology. 34. (1988)

Y. Yamada：普通与应用微生物学杂志。

Y. Yamada: Gournal of General and Applied Microbiology. 34. (1988)

Y. Yamada：普通与应用微生物学杂志。