細胞内小器官における膜輸送機構の解析に関する研究

细胞内细胞器膜转运机制分析研究

• 批准号: 62570410
• 负责人: 五十嵐 裕
• 金额: $ 1.47万
• 依托单位: Tohoku University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1987
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1987 至 1988
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-62570410/
• 关键词: 糖原病Ib型; 糖原病Ic型; 細胞内小器官; ミクロゾーム; 膜輸送グルコース-6-リン酸(G6P); ピロリン酸; G6P輸送系; 燐輸送系; G6Pase; 膜輸送

ラット肝ミクロゾ-ム膜においてグルコ-ス-6-リン酸(G6P)輸送系と対をなして存在していると考えられているりん酸の輸送系の存在を明らかにするとともに、その質的な解析を行なうためにピロリン酸PPiの取り込みに関する実験を行なった。G6P輸送系の解析の方法と同様に40mMカュジレート緩衝液(PH6.0)、肝ミクロゾーム分画200μgと1mMPPiを0.5μci^<32>P-PPiをトレーサーとして230℃で0〜5分間インキュベート(final volume0.5ml)した。反応停止は反応液に氷冷した20倍量の0.25M蔗糖に50mMTris-cl Butter(pH7.5)25mMKclを含む液を注入して行なった后、直ちにガラスメンブランフィルター(whatman GF/F)上にミクロゾーム分画を集め、5mlの上記溶液で2回洗浄した。このフィルターを風乾後、液体シンチレーションカンウターで放射活性の測定を行なった。この方法ではG6Pの場合と異なり、フィルター上にミクロゾーム分画を除いた反応液を注いだだけでも高い放射活性となり、ミクロゾーム分画への取り込みが測定出来なかった。そこで洗浄の条件、洗浄液等を種々検討した結果、フィルターを50mM程度のPPiを含む反応停止液にひたしてから使用することにより、フィルターへの^<32>P・の吸着量はかなりの程度減少した。しかし、ミクロゾームへの取り込みについては、蛋白量、基質濃度、温度条件等について種々検討したが、いまだ明らかなPPiの取り込みを示唆する結果は得られていない。糖原病Ib患者の肝ではPPi phospho hydrolose 活性にミクロゾーム膜破壊及び未破壊で差のあること、又PPiの輸送系の欠損によると考えられるIcの存在の報告、さらに直接取り込みを明らかにした等の報告がみられているが、現在まで我々の実験からは直接的な結果は得られていない。方法論をさらに検討するとともにIc型の発見につとめ、さらに検討したい。

The existence of a transport system for 6-hydroxy-6-carboxylic acid (G6P) in a membrane is investigated. The existence of a transport system for 6-hydroxy-6-carboxylic acid is investigated. G6P transport system analysis method and the same for 40mM buffer solution (pH 6.0), liver-based solution of 200μg to 1mMPPi to 0.5μci of <32>P-PPi to change the temperature of 230℃ between 0 ~ 5 minutes to change the final volume of 0.5ml. After the reaction was stopped, a 20-fold amount of 0.25 M sucrose, 50 mM Tris-Cl Butter(pH 7.5), 25 mM KCl and a solution containing methanol were injected into the reaction mixture, and then 5ml of the above solution was used for 2 backwashes. After drying, the radioactivity of the liquid was measured. This method is used to determine the activity of G6P in different situations. The results of the analysis of the washing conditions, washing solutions, etc. show that the amount of PPi in the reaction solution containing 50mM is reduced<32>. In addition, the results of the analysis of the protein content, matrix concentration, temperature conditions, etc. are shown in the table below. In patients with glycogen disease Ib, PPi phosphohydrate activity in the liver was detected by direct detection of the presence of Ic in the absence of membrane breakdown and non-breakdown, and by direct detection of PPi transport system deficiency. Methods: To investigate the occurrence of type Ic disease.