ハイブリッド法を用いた脳におけるNa,K-ATPaseアイソザイム発現の研究

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Na,K-ATPaseは、あらゆる高等動物細胞の形質膜に存在し、Na^+イオンとK^+イオンの能動輸送をになう酵素であり、2つのサブユニットから成る。即ち触媒作用をもつαサブユニットと、機能の不明な糖タンパクであるβサブユニットである。最近、cDNAクローニング法により、ラット脳にはαサブユニットが3種類あることが見出された(α_1、α_2、α_3型)。α_1サブユニットは、ほとんどあらゆる組織中に存在するけれども、α┣D22とα┣D23┫D2サブユニットは脳に特異的である。そこで本研究おいて、我々はラット大脳皮質において、ニューロンとグリア細胞のうちいずれの細胞が、α┣D22┫D2あるいはα┣D23┫D2サブユニットを発現しているのか、ハイブリッド法を使って調べた。実験動物には、S-D系成熟ラット雄を用いた。4%パラホルム固定液でラットを潅流固定後、大脳皮質の凍結切片(厚さ8μm)を作製した。cDNAプローブとして、既に得られているα┣D22┫D2およびα┣D23┫D2サブユニットをコードするcDNAを制限酵素で切断し、3'-非翻訳領域のみを含む断片を┣D135┫D1Sでアイソトープラベルしたものを使用した。スライドグラス上に貼付された切片を、HCl、およびNaCl-Nacitrate液を通した後、pronase処理を行なった。さらにglycine、 paraformaldehyde処理を切片に施し、空気乾燥させた。次に切片をプローブ液とハイブリダイズさせた(37℃24時間)。ハイブリダイズ後、formide液で十分切片を洗浄後、脱水ー空気乾燥した。最後に切片にオートラジオグラフィー処理を行なった。実験結果によれば、α┣D22┫D2およびα┣D23┫D2サブユニットのmRNAは、ニューロンとグリア細胞いずれにも検出され、グリア細胞についてもアストロサイト、オリゴデンドロサイト共に発現されていた。しかしながら、血管内皮細胞には発現されていなかった。今後、対照実験として、α┣D22┫D2、α┣D23┫D2サブユニットが生化学的には検出されない組織を使って、ハイブリッド法の反応特異生をチェックしてみる予定である。