パッチクランプ法による視床下部ニューロン温度受容機構の解析

膜片钳法分析下丘脑神经元温度感受器机制

• 批准号: 63570079
• 负责人: 小林 茂夫
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1988
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1988 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-63570079/
• 关键词: パッチクランプ; 温度受容ニューロン; スライス; 視床下部

当初、ラット視床下部を酵素処理して単離したニューロンを用いてパッチクランプを行う予定であった。しかし温度受容ニューロンにパッチクランプ記録を適用する方法を高橋が開発したため、新方法に変更した。新方法と結果を以下に述べる。ラット視束前野の中心線付近から厚さ100ミクロンの矢状断スライスを作り、鏡筒可動型ノマルスキー顕微鏡ステージ上の記録容器にスライスを固定した。シナプス入力を遮断するため、クレブス液のCaをMgで置換した低Ca液でスライスを灌流し、温度に直接的に反応するニューロンだけを実験対象とした。顕微鏡(400倍)で直視し、ニューロン(細胞体直径10ー15μm)周囲の結合織をクレブス液のジェット流により吹き飛ばし吸引により除去することで、細胞体表面を露出した。パッチクランプ電極(先端直径1〜2μm)を細胞体に近づけわずかな陰圧を加え電極先端と膜との間にゆるいシールを形成すると、自発発火活動が細胞外から記録可能であった。25ー35℃の温度変化を加え、発火頻度の変化する温度受容ニューロンを同定した。この実験では、温細胞の解析にしぼった。新たなパッチ電極と同定した温細胞との間に密着したシールを形成した後、電極に加える陰圧を強め電極先端の細胞膜を破壊し、電極内と細胞内を交通させた。電流固定下の静止電位は、約-60mVであった。温度を25ー35℃に変え、膜電位固定下に静止電位から過分極側にステップ電位を加えて電流を記録することにより電流電圧直線を求めた。すると、温度上昇に伴って、膜コンダクタンスが上昇し、膜電位が上昇した。高温と低温で得た2つの電流電圧直線の交点の電位は、約-40mVであり、これは、温度に応じて変化するチャンネル(温度受容チャンネル)の平衡電位と考えられた。今後、外液のイオン組成を変えた時の平衡電位の変化から、温度受容チャンネルを通るイオン種を同定する実験を計画している。

At the beginning, the enzyme in the lower part of the viewing table was used to determine the distance between the two. A new method of temperature regulation is proposed. The results of the new method are described below. The center line of the front field of the beam is close to the thickness of 100 cm. The sagittal section of the lens barrel is fixed. The recording container of the lens barrel is movable. In addition, the temperature of the solution can be adjusted by changing the Ca content of the solution. Microscope (400 ×): Direct view, cell surface (cell body diameter 10 - 15μm): circumferential binding tissue, fluid flow, suction, removal, cell body surface exposed. The electrode (tip diameter 1 ~ 2μm) is close to the cell body, and the negative pressure is added to the electrode tip. The electrode tip is formed in the middle of the membrane. The spontaneous fire activity is recorded outside the cell. The temperature change of 25 ℃ to 35℃ is increased, the frequency of fire is changed, and the temperature is adjusted. The analysis of temperature and temperature cells. The new electrode is stable, the cell is dense, the electrode is strong, the cell membrane is broken, the electrode is in the cell The static potential at fixed current is about-60mV. Temperature: 25 - 35℃, membrane potential: fixed static potential: electrode side: static potential: added current: recorded current: straight line: calculated When the temperature rises, the membrane temperature rises and the membrane potential rises. The potential of the intersection of the current voltage line obtained at high temperature and low temperature is about-40 mV, and the equilibrium potential of the current voltage line is about-40 mV. In the future, when the composition of the external liquid is changed, the equilibrium potential is changed, and the temperature is changed.