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カイコ脂肪体細胞における外来遺伝子発現系の確立

家蚕脂肪体细胞外源基因表达系统的建立

基本信息

批准号：
01540604
负责人：
泉進
金额：
$ 1.15万
依托单位：
Tokyo Metropolitan University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1989
资助国家：
日本
起止时间：
1989 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

昆虫の体液タンパク質は脂肪体という組織において幼虫期に合成されている。カイコの体液タンパク質のうち貯蔵タンパク質SP1、SP2および主要体液タンパク質の遺伝子はすでにクロ-ニングが完了しており、それらの構造および発現様式がかなり明らかになりつつある。本研究では、これらの遺伝子を脂肪体細胞に再導入し、in vitroでの遺伝子発現の調節機構を解明する実験系の開発に主眼を置いてきた。この実験系を確立する上で最も重要な問題は、脂肪体細胞のプライマリ-カルチャ-の条件を決定することである。5齢幼虫2日目の個体より脂肪体を摘出した生理食塩水で洗浄後、トリプシンで消化し脂肪体細胞を単離した。その後培養液Tc10で単離脂肪体細胞の培養を試みた。その結果、トリプシン5mg/mlで30分消化後、出来るだけ機械的ショックを少なくして細胞を単離することが重要であると判明した。現在この条件で単離した脂肪体細胞は単離後24時間で約70%の生存率で示し、単離時のタンパク質合成能を失うことなく約2週間培養を続けることが可能となった。この脂肪体のプライマリ-カルチャ-細胞はシャ-レ表面に強固にはりつき、細胞をシャ-レからはがす際、機械的処理を行うと生存率がかなり低下する。またトリプシン処理を行い細胞を遊離させても生存率の低下が見られた。このような細胞を用いて赤血球ゴ-ストと細胞融合を行ったが、ほとんどの細胞が死滅してしまうことが判明した。そこで当初の予定を変更し、DEAE-デキストラン法およびリポソ-ム法を用いた形質転換実験を行った。現在、これらの方法の実験条件の検討を行っているが、形質転換の際の培養液の組成が外来DNAの細胞への取込みに大きな影響を及ぼすことが明らかとなった。この条件が決定ししだい、体液タンパク質遺伝子のトランジェントな発現を解析する予定である。

Insect body fluids are synthesized in the larval stage. The body fluid of the sample is stored in the sample SP1, SP2 and the main body fluid of the sample SP1, SP2. The sample SP1, SP2 and the main body fluid of the sample SP1, SP2 are stored in the sample SP1, SP2 and SP1. This study aims to clarify the regulatory mechanisms of gene expression in adipocytes and to clarify the development of gene expression systems. The most important problem in establishing this system is the determination of the conditions for fat cell growth. 5. Larvae 2-day-old individual fat body is extracted, physiological water is washed, and fat body cells are digested. The culture medium Tc10 was used to isolate adipose cells. The results of this study were as follows: 1. Digestion of 5mg/ml was performed after 30 minutes, and the results were as follows: Under these conditions, the survival rate of adipocytes was about 70% at 24 hours after isolation, and the ability of protein synthesis was lost at about 2 weeks after isolation. The fat body is hard to maintain, the cells are hard to maintain, and the survival rate is low. The survival rate of the cells in the middle of the treatment was low. The cells were destroyed by cell fusion. The original design changes, DEAE-DST method and DST method are used in the form of quality change. Now, the method of implementation of the study, the quality of the medium composition of foreign DNA in the cell to obtain a large impact on the study and the study. This condition determines whether or not the body fluid is present.