ダニ抗原のクロ-ニング

蜱抗原的克隆

• 批准号: 01560097
• 负责人: 小埜 和久
• 金额: $ 0.9万
• 依托单位: Hiroshima University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1989
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1989 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-01560097/
• 关键词: ダニ; 喘息; アレルギ-; ワクチン; 減感作治療; cDNA; Dermatophagoides farinae; クロ-ニング

ダニ喘息は、I型アレルギ-疾患であり、抜本的な治療法としては、減感作療法が唯一のものと考えられ、これには、安全で確実にワクチンとして奏功する充分量の治療用ダニ抗原の供給が不可欠である。しかし、ダニ飼育物中に微量に存在する多種類の抗原から、個々の患者で異なる発症感作抗原を高純度に、しかも多量に調整することは困難と考えられる。そこで、ワクチンとして有効に機能する減感作治療用のダニ抗原の安定な大量生産を実現するために、ダニ虫体中の主要アレルゲン蛋白質をコ-ドする遺伝子をクロ-ニングした。ダニ虫体からRNAを抽出後、Oligo(dT)-celluloseでpoly(A)-mRNAを分画し、そのcDNAを調整した。それにEcoR1 リンカ-をつけてλgtllに組り込み約60万pfuの組換えファ-ジを得た。これらを大腸菌に感染後、IPTG浸漬ニトロセルロ-スにブロッティングして、ウサギ抗ダニ虫体血清で免疫スクリ-ニングし、これに強く反応するプラ-クを、二次免疫スクリ-ニングしてダニ抗原・β-ガラクトシダ-ゼ融合蛋白を発現するファ-ジ59クロ-ンを得た。このうちの9クロ-ンを、IPTG存在下で大腸菌に感染させ、その培養上清をウサギ抗ダニ虫体血清を用いたELISA法で、また、SDS-PAGE法で調べた結果、いずれもβ-ガラクトシダ-ゼ融合蛋白として発現していることを確認した。また、固定化ウサギ抗ダニ虫体抗カラムで融合蛋白を精製したところ、ダニ喘息患者の特異lgGとも強く反応した。このうちのミニライゼ-ト法により1150bpと推定される挿入cDNAには、2ヵ所Acc l,Cla l,及び1ヵ所のBamH l,EcoR 1,EcoR V制限酵素切断部位があった。このcDNAをpUC18に組み直し、ジデオキシ法により全塩基配列を解析中である。更に、これを室岡の開発した異種遺伝子高発現ベクタ-につなぐことによって、ダニ抗原の安定な大量生産も可能な見通しとなってきた。

ダ ニ breathing は, type I ア レ ル ギ - disorders で あ り, sorting this な therapy と し て は, desensitization therapy only の が も の と exam え ら れ, こ れ に は, safety で indeed be に ワ ク チ ン と し て play work す る full amount の therapeutic ダ ニ antigen の supply が not owe で あ る. し か し, ダ ニ rearing of trace に に exist す る variety の antigen か ら, a 々 の で patients with different な る 発 を high-purity に sense as antigen, し か に も much quantity adjustment す る こ と は difficult と exam え ら れ る. そ こ で, ワ ク チ ン と し て have sharper に function す る desensitization for treatment の ダ ニ antigen の settle な mass-produced を be presently す る た め に, ダ ニ worm の mainly ア レ ル ゲ ン protein を コ - ド す る posthumous son 伝 を ク ロ - ニ ン グ し た. を ダ ニ worm か ら RNA extraction, Oligo (dT) - cellulose で poly real (A) - mRNA を painting し, そ の cDNA を adjustment し た. そ れ に EcoR1 リ ン カ - を つ け て lambda GTLL に group り 込 み about 600000 pfu の group in え フ ァ - ジ を た. こ れ ら を coliform に after infection, IPTG dipping ニ ト ロ セ ル ロ - ス に ブ ロ ッ テ ィ ン グ し て, ウ サ ギ resistance ダ ニ worm で immune serum ス ク リ - ニ ン グ し, こ れ に く reverse 応 す る プ ラ ク - を, secondary immune ス ク リ - ニ ン グ し て ダ ニ antigen, beta ガ ラ ク ト シ ダ - ゼ fusion protein を 発 now す る フ ァ - 59 ジ ク ロ - Youdaoplaceholder1 を get た. こ の う ち の 9 ク ロ - ン を, IPTG で in the presence of coliform に infection さ せ, そ の culture supernatant を ウ サ ギ resistance ダ ニ insect body serum を い た で ELISA method, ま た, sds-page method で べ た results, い ず れ も beta ガ ラ ク ト シ ダ - ゼ fusion protein と し て 発 now し て い る こ と を confirm し た. ま た, immobilized ウ サ ギ resistance ダ ニ insect body カ ラ ム で fusion protein を refined し た と こ ろ, ダ ニ breathing patients の specific lgG と も く reverse 応 し た. こ の う ち の ミ ニ ラ イ ゼ ト method に よ り 1150 bp と presumption さ れ る scions into cDNA に は l, 2 ヵ Acc, Cla, l and 1 ヵ び の BamH l, 1, EcoR EcoR V system limited enzyme cut parts が あ っ た. In the を cDNAをpUC18に group み direct に, ジデ ジデ キシ キシ method によ <s:1> all-base arrangement を analysis である. More に, こ れ を chamber okada の open 発 し た heterogeneous legacy 伝 child high 発 now ベ ク タ - に つ な ぐ こ と に よ っ て, ダ ニ antigen の settle な mass-produced も may な see tong し と な っ て き た.

项目成果

S.Shigeta et al.,: "N-Acetylgalactosaminyl disaccharide terminals contained in presumed carbohydnote epitopes specific to seaーsquirt allergy" J.Biochem. 105. 691-696 (1989)

S.Shigeta 等人，：“推测的海鞘过敏特异的碳水化合物表位中含有 N-乙酰半乳糖胺基二糖末端”J.Biochem. 105. 691-696 (1989)

M.Ohta et al.,: "Sugar sequences of allergenically active oligo sacharide alcshols isolated from a large-molecular size sea squirt antigen termed H-antigen." Arch.Biochem.Biophys. 275. 151-165 (1989)

M.Ohta 等人：“从称为 H 抗原的大分子海鞘抗原中分离出的过敏活性寡糖醇的糖序列。”

T.Jyo et al.: "Therapeutic effect and titers of the specific IgE and IgG antibodies in cases of sea-squirt allergy(Hoya Asthma)under a long ferm hyposensitization with three sea sqlirt antigens" J.Allergy Clin Imnunol. 83. 388-393 (1989)

T.Jyo 等人：“在三种海鞘抗原长期脱敏作用下，海鞘过敏（Hoya Asthma）病例中特异性 IgE 和 IgG 抗体的治疗效果和效价”J.Allergy Clin Imnunol。

S.Shigeta et al.,: "Improvement in the therapeutic officacy of an asthma-inducing squirt antigen termed DIIIa by its palymerization in hyposensitization of sea squirt allergy" Jpn.J.Allergol.39. (1990)

S.Shigeta 等人，：“通过多聚化，提高称为 DIIIa 的诱发哮喘的海鞘抗原的治疗功效，使其对海鞘过敏的脱敏作用降低”Jpn.J.Allergol.39。

山口武志,他: "白血球ヒスタミン遊離測定による低分子ダニアレルゲンの解析" 日本農芸化学会大会講演要旨集. 64. 217 (1990)

Takeshi Yamaguchi 等人：“通过测量白细胞组胺释放来分析低分子量螨虫过敏原”日本农业化学学会会议记录 64. 217 (1990)。