神経分化決定期に現われる神経誘導物質mRNAの機能的固定とcDNAクロ-ニング

神经元分化决策阶段出现的神经诱导剂mRNA的功能固定和cDNA克隆

• 批准号: 01570059
• 负责人: 岡本 治正
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1989
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1989 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-01570059/
• 关键词: アフリカツメガエル; 初期胚細胞培養; 神経誘導物質; mRNA; cDNA; 単クロ-ン抗体

脊椎動物では嚢胚期に背側中胚葉と接触した外胚葉部分から神経系が形成され、この時点での両胚葉細胞間作用が神経系発生に対し決定的役割を果たす事が知られている。本研究ではこの細胞間作用をになう神経誘導物質の同定をめざした。既に報告した通り、アフリカツメガエル初期嚢胚の未決定外胚葉細胞と予定背側中胚葉細胞(以下DMZ細胞)のそれぞれ少数(150-15)をとって混合培養すると神経細胞が分化してくる(抗樹状突起単クロ-ン抗体N1により確認)この時、DMZ細胞をCa、Mg-free液でよく洗い込むと、その神経誘導作用が著明に下る事、さらにDMZ細胞洗い液を混合培養系に添加すると神経細胞の分化が促進される事も新たに見出され、DMZ細胞表面に2価イオン依存的に結合した物質が神経誘導作用に関与する可能性が強く示唆された。一方誘導物質の化学的実体としては少なくともその一部が蛋白質であると予想されており、上記DMZ細胞表面物質をコ-ドするmRNAが嚢胚期以前の胚中に存在する事が期待された。このmRNAを同定する一つの方法として、初期胚mRNAをツメガエル卵母細胞に注入・翻訳させ卵母細胞のCa、Mg-free洗い込み液中に出現する神経細胞分化促進作用を指標として、対応するcDNAをクロ-ニングする事が考えられる。そこで先ず卵母細胞翻訳系が一般的にツメガエル胚mRNAに対するcDNAクロ-ニングに有効か否か検討する目的で、胚組織特異的抗原に対するcDNAのクロ-ニングを試みた。その結果表皮特異的E2抗原をコ-ドするmRNA分画が見出され、この分画からcDNAライブラリ-を作製した。現在約二万クロ-ンよりなるサブライブラリ-から調整したDNAをin vitroで転写してmRNAに変換後、これを卵母細胞に注入して、E2抗原の翻訳が単クロ-ン抗体により確認されているので、今後サブライブラリ-の大きさを徐々に小さくしていけば最終的にE2抗原mRNAに対する単一cDNAクロ-ンが得られるものと思われる。

In vertebrates, the embryonic dorsal mesoderm contacts the ectoderm, and the embryonic intercellular interaction determines the development of the neuroderm. In this study, we investigated the effects of neuro-inducers on cell interaction. A few (150-15) of the undetermined ectodermal cells of the early embryo and the predetermined dorsal mesodermal cells (DMZ cells) were mixed and cultured for differentiation of the neuronal cells.(Anti-dendrimer antibody N1 confirmed) At this time, DMZ cells were washed with Ca and Mg-free solution, and the neuroinduction effect was observed. At this time, DMZ cells were washed with mixed culture system, and the differentiation of neurocytes was promoted. The possibility of neuroinduction by 2-D dependent binding substances on DMZ cell surfaces is strongly demonstrated. The chemical substance of one side induces the presence of some protein in the embryo before the embryonic stage, and some mRNA on the surface of DMZ cells is expected. A method for the identification of mRNA in embryonic embryos is described. The mRNA is injected into oocytes and transformed into Ca and Mg-free washing solutions of oocytes. An indicator of the promotion of neural cell differentiation is the presence of cDNA in oocytes. The first oocyte transformation system is a general one, and the embryo mRNA is related to the cDNA. As a result, epidermal specific E2 antigen was detected by mRNA analysis, and cDNA analysis was performed. About 20,000 copies of E2 antigen have been identified in vitro after mRNA conversion and injection into oocytes. In the future, E2 antigen mRNA will be identified as a single cDNA copy.

项目成果

Mitani,S.: "Embryonic development of Xenopus studies in a cell culture system with tissue-specicic monoclonal antibodies." Development. 105. 53-59 (1989)

Mitani,S.：“利用组织特异性单克隆抗体在细胞培养系统中研究非洲爪蟾的胚胎发育。”

Mitani,S.: "The differentiation of melanophores in vitro from embryonic cells of Xenopus laevis." J.Physiol.Soc.Japan. 39. S27 (1989)

Mitani,S.：“非洲爪蟾胚胎细胞中黑素细胞的体外分化。”