遺伝子増幅法を用いたウィルス性心筋炎の診断

基因扩增法诊断病毒性心肌炎

• 批准号: 01570468
• 负责人: 土持 英嗣
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1989
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1989 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-01570468/
• 关键词: 拡張型心筋症; コクサッキ-ウィルス; 持続感染; 遺伝子増幅法

本研究の最終目的は、拡張型心筋症(DCM)の一つの発症機序とされる心筋内でのウィルス持続感染の有無をgene amplification(PCR:polymerase chain reaction)の手法を用いることより、正確に診断するところにある。これまでに、西独のKandolfらによりDCM患者の心筋内にコクサッキ-ウィルスの潜在感染が、高率に存在することが報告されているものの、その手法は非特異的反応の多いdot blotting法であり、コクサッキ-ウィルスの存在を示す確実な根拠はない。そこで我々は、PCRを用いて心筋におけるコクサッキ-ウィルスの持続感染の可能性、及び、DCM患者心筋での本ウィルスの存在につき検討した。まず、本ウィルスの異なった2ヶ所の部位で、sense、 antisenseの2個づつのprimerを作製した。一方、心筋よりRNAを抽出し、逆転写酵素により一担cDNAに変換した後、これらのprimerを用いてPCRを行い、目的とする遺伝子が存在するか否かを電気泳動により確認した。その結果、C_3Hマウスにおいては、ウィルス接種後1〜2週目までは心筋内での本ウィルス遺伝子の存在を確認しえたものの、2週目以降は確認不可能であった。ヒトDCM心筋においてもRNAを採取し得た11例の症例のうち、本ウィルス遺伝子の存在を示す根拠には得られなかった。また、本ウィルスがantisenseの状態で存在している可能性もふまえ、同様の実験を行ったが、いずれもその根拠は得られなかった。以上より、心筋内でのコクサッキ-ウィルスの持続感染は、実験例、及び臨床例において否定的である可能性が高いと結論された。従って、Kandolfらの報告は、dot blottingという手法ゆえの非特異的反応をみている可能性があると考えられる。今後、コクサッキ-ウィルス以外のウィルス存在に関し、発現ベクタ-を用いてcDNA libraryの作製等を行っていく必要がある。

这项研究的最终目的是准确诊断心肌内是否存在持续的病毒感染，这被认为是使用聚合酶链反应（PCR）技术来开发扩张心肌病（DCM）的机制。虽然Kandolf等。在西德，以前已经报道说，DCM患者的心肌中存在潜在的Coxacchi-病毒病毒感染，该方法是一种具有大量非特异性反应的DOT印迹方法，并且没有coxacacchi-virus的稳固基础。因此，我们研究了使用PCR在DCM患者的心肌中持续感染coxacchi-birus持续感染的可能性。首先，在该病毒的两个不同部分中，准备了两个底漆，一个逐一和一一。另一方面，从心肌中提取RNA，使用逆转录酶将RNA转化为单支cDNA，并使用这些引物进行PCR，以确认靶基因是否通过电泳存在。结果，尽管从病毒接种后的第一周到第二周，在C_3H小鼠中证实了该病毒基因在心肌中的存在，但在第二周后没有得到证实。在人类DCM心肌中收集RNA的11例中，没有作为存在该病毒基因的证据。此外，考虑到这种病毒存在于反义状态的可能性，但没有获得任何证据，就进行了类似的实验。从上面可以得出结论，在实验和临床病例中，心肌中持续感染了coxacchi-virus的持续感染可能是阴性的。因此，认为Kandolf等人的报告可能被视为非特异性响应，这是由于DOT印迹的方法。将来，有必要使用表达矢量来创建cDNA文库，以使其存在于Kokusacchi病毒以外的其他病毒。

项目成果

黒尾誠: "Developmentally regulated expression of vascular smooth muscle myosin heavy chain isoforms." J.Biol.Chem.(1989)

Makoto Kuroo：“血管平滑肌肌球蛋白重链亚型的发育调节表达。”J.Biol.Chem.(1989)

倉林昌彦: "Molecular cloning and characterization of human atrial and ventricular myosin alkali light chain cDNA clones." J.Biol.Chem.263. 13930-13936 (1988)

Masahiko Kurabayashi：“人心房和心室肌球蛋白碱轻链 cDNA 克隆的分子克隆和表征。J.Biol.Chem.263 (1988)。