心筋カリウムチャンネルの遺伝子クロ-ニングと機能解析

心脏钾通道基因克隆及功能分析

基本信息

批准号：
02670381
负责人：
土持英嗣
金额：
$ 1.41万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1990
资助国家：
日本
起止时间：
1990 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-02670381/
关键词：
カリウムチャンネル遺伝子クロ-ニング Xenopus oocyte

项目摘要

心筋には,異った機構によりその開閉が制御される数種のKチャンネルCoutward type,inward type,ATP依存性Kチャンネル等)が存在し,各々が,病態生理において重要な役割を担うことが示唆されている。これらのうち,outward typeに関しては,本遺伝子が,shaker遺伝子と,ホモロジ-が高いことより,この一年間のうちに,いくつかのグル-プより,脳,心筋でのクロ-ニングの成功が学会発表されている。我々も,家免脳より,Kチャンネル遺伝子の単離を行い,その塩基配列を決定した。得られたクロ-ンは,全長2.3kbで,1431b.p.のopen reading frameをもち,477残基のアミノ酸をコ-ドしていた。計算上の分子量は53879であった。本遺伝子は,ラット脳で報告されているRBKIと80%以上の相同性をもち,特に膜貫通部は,H_2でI→F,H_4でF→Iの相違が認められるのみで,その他のアミノ酸は全て一致していた。本クロ-ンをT_7プロモ-タ-をもつベクタ-に組み込むことより,cRNAを作製し,これをXenopus oocyteに注入,その発現蛋白を電気生理学的に解析した。その結果,膜電位依存性にSNAのAtupe outward電流が観察された。この電流はTetra ethyl ammonium(EC50=10mM),4ーAmino pyridiue(EC50=0.1mM),及び,Banium chloride(EC50=10mM)により抑制された。また,外液のK濃度を変化させた際のreversal potontialが100mMであることより,本電流はK電流であることが観察された。本クロ-ンはoocyte注入后,24時間以内に,その蛋白が発現されることより,今后oocyte発現系における有力なpositive controlとして用いることが可能である。そこで,本クロ-ンの発現を指標として,現在,その構造解明にしのぎがけずられているin ward type,及びATP依存性Kチャンネルの発現クロ-ニングを遂行中であり,来年度中には,その構造が我々の手により解明されることが期待される。

心肌具有多种K通道（Coutward类型，内向类型，依赖ATP的K通道等），其开放和关闭受不同机制控制，这表明每种机制在病理生理学中起着重要作用。至于外在类型，该基因与振动筛基因具有很高的同源性，导致了几个小组在过去一年中呈现克隆在大脑和心肌中的成功。我们还将K通道基因从日本阳性分离出来，并确定基本序列。最终的克隆长度为2.3 kb，开放式阅读框为1431年。和477个残基的编码氨基酸。计算出的分子量为53,879。该基因与在大鼠脑中报道的RBKI具有超过80％的同源性，尤其是跨膜部分仅显示H_4中H_2和F_4的I→F和F→I之间的差异，并且所有其他氨基酸都一致。通过将该克隆与T_7启动子掺入载体中，产生了CRNA，并将其注射到Xenopus卵母细胞中，并通过电生理学分析了表达的蛋白。结果，在膜电位依赖性中观察到了SNA的Atupe向外电流。该电流被四乙基铵（EC50 = 10mm），4-氨基吡啶菌（EC50 = 0.1mm）和氯化ami含量（EC50 = 10mm）抑制。此外，观察到该电流是K电流，因为当外部液体的K浓度为100 mm时，逆转电势。由于蛋白质在囊囊注射后24小时内表达，因此该克隆可以用作阳性表达系统中有效的阳性对照。因此，我们目前正在使用该克隆作为指示器的表达来阐明内外类型和ATP依赖性K通道的表达克隆，我们希望明年的结构能够阐明该结构。