アフリカツメガエル印母細胞発現系によるATP依存性Kチャンネルの単離

使用爪蟾印戒母细胞表达系统分离 ATP 依赖性 K 通道

基本信息

批准号：
02257204
负责人：
土持英嗣
金额：
$ 1.09万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1990
资助国家：
日本
起止时间：
1990 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究を遂行するにあたって必須となるものは適切なpositive controlの開発と,これを用いたXenopns oocyteの発現系の確立である。そこで本年度はウサギ脳より、膜電位依存性のKチャンネルcDNAを単離し,そのcRNAをoocyteに注入し発現させることにより,本イオンチャンネルの解析を行った。まずShaker遺伝子に関連したRBK1(Science,221,1989)の塩基配列をもとにpolymerase chain reaction法によりプロ-ブを作製,これを用いてウサギ脳のcDNAライブラリ-より,全長2,3kbのクロ-ン(BSH51)を得た。本クロ-ンは1431b.pのopen reading frameをもち,477残基のアミノ酸をコ-ドし,その分子量は53879であった。ラット脳のKチャンネルであるRBK1との相同性は約80%であり,特に膜貫通部はH_2でI→F,H_4でF→Iの相違が認められる他は定全に一致していた。本クロ-ンをT_7プロモ-タ-をもつベクタ-に組み込むことより,cRNAを作製し,これをXenopus oocyteに注入することよりその発現蛋白を電気生理学的に解析した。その結果,膜依存性に〜5μAのAtype outuard電流を観察した。本電流はTetraethy lammonium(Ec50=0.1mM),4ーAminopyridine (Ec50=0.1mM),及びBarium cbhoride (EC_<50>=10mM)により抑制され,また外液のK濃度卸を変化させた際のreversal potentialより,本電流が,K電流であることが推測された。本クロ-ンはoocyte注入后,24時間以内にその蛋白が発現されることにより,今后oocyte発現系によるクロ-ニングに際し有力なpositive controlとして用いることが可能となる。そこで現在,本クロ-ンの発現を指標として本研究の主題であるATP依存性Kチャンネルの検索を行っているところである。尚申請者は,本学でのR.Iの使用が不能になっていることより渡米してこれを遂行中であることを付記する。

这项研究的重要部分是使用此研究建立适当的阳性对照并建立Xenopns卵母细胞的表达系统。因此，今年，我们从兔子的大脑中分离了膜电压依赖性的K通道cDNA，并通过将CRNA注射到Ocytes中并表达它来分析该离子通道。首先，通过聚合酶链反应方法根据RBK1的基础序列（Science，221，1989）制备了探针，并从兔子脑cdna库中获得了总长度为2,3 kb（BSH51）的克隆。该克隆的开放式阅读框为1431b.p，编码了477个残基的氨基酸，其分子量为53879。与RBK1（RBK1）的同源性，大鼠脑中的K通道的同源性约为80％，跨膜部分的差异确实是一致的，因为I→F→F→I IN__2和F__2和F_2和F_2和F_2和F_4。通过将该克隆与T_7启动子掺入载体中，产生了CRNA并将其注射到爪蟾卵母细胞中，对表达的蛋白质进行了电生理学分析。结果，我们观察到了〜5μa的薄膜依赖性Atyper室外电流。四乙基lammonium（EC50 = 0.1mm），4-氨基吡啶（EC50 = 0.1mm）和CBHORIDE（EC_ <50> = 10mm）抑制了该电流，并且估计当外部液体的晶球浓度发生了变化时，该电流是从反向电位的k电流。该克隆可以用作使用Ocyte表达系统克隆的有效阳性对照，因为该蛋白在注射Ocyte后24小时内表达。因此，我们目前正在使用该克隆作为指标的表达来搜索本研究的主题ATP依赖性K通道。此外，申请人会注意到，大学无法使用R.I，因此他已搬到美国并目前正在执行此操作。