アフリカツメガエル印母細胞発現系によるATP依存性Kチャンネルの単離

使用爪蟾印戒母细胞表达系统分离 ATP 依赖性 K 通道

• 批准号: 02257204
• 负责人: 土持 英嗣
• 金额: $ 1.09万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1990
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1990 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-02257204/
• 关键词: ATP依存性Kチャンネル; 遺伝子クロ-ニング; 発現クロ-ニング; Xenopns oocyte

本研究を遂行するにあたって必須となるものは適切なpositive controlの開発と,これを用いたXenopns oocyteの発現系の確立である。そこで本年度はウサギ脳より、膜電位依存性のKチャンネルcDNAを単離し,そのcRNAをoocyteに注入し発現させることにより,本イオンチャンネルの解析を行った。まずShaker遺伝子に関連したRBK1(Science,221,1989)の塩基配列をもとにpolymerase chain reaction法によりプロ-ブを作製,これを用いてウサギ脳のcDNAライブラリ-より,全長2,3kbのクロ-ン(BSH51)を得た。本クロ-ンは1431b.pのopen reading frameをもち,477残基のアミノ酸をコ-ドし,その分子量は53879であった。ラット脳のKチャンネルであるRBK1との相同性は約80%であり,特に膜貫通部はH_2でI→F,H_4でF→Iの相違が認められる他は定全に一致していた。本クロ-ンをT_7プロモ-タ-をもつベクタ-に組み込むことより,cRNAを作製し,これをXenopus oocyteに注入することよりその発現蛋白を電気生理学的に解析した。その結果,膜依存性に〜5μAのAtype outuard電流を観察した。本電流はTetraethy lammonium(Ec50=0.1mM),4ーAminopyridine (Ec50=0.1mM),及びBarium cbhoride (EC_<50>=10mM)により抑制され,また外液のK濃度卸を変化させた際のreversal potentialより,本電流が,K電流であることが推測された。本クロ-ンはoocyte注入后,24時間以内にその蛋白が発現されることにより,今后oocyte発現系によるクロ-ニングに際し有力なpositive controlとして用いることが可能となる。そこで現在,本クロ-ンの発現を指標として本研究の主題であるATP依存性Kチャンネルの検索を行っているところである。尚申請者は,本学でのR.Iの使用が不能になっていることより渡米してこれを遂行中であることを付記する。

The development of positive control and the establishment of a system for the development of Xenopns oocyte are essential to the success of this study. This year, we will analyze the gene expression and membrane potential-dependent gene expression of cRNA and oocyte. The gene sequence of RBK1 (Science,221,1989) was prepared by polymerase chain reaction method. The cDNA sequence of RBK1 (Science, 221,1989) was 2,3 kb in length. The open reading frame of this protein is 1431b.p, and the residue 477 is 53879. The identity of RBK1 is about 80%, especially the identity of H2 → F, H4 →I. This article discusses the electrophysiological analysis of cRNA gene expression in Xenopus oocyte. As a result, the membrane-dependent Atype outuard current of ~ 5μA was observed. This current is inhibited by Tetraethy lammonium(EC50 =0.1mM), 4-Aminopyridine (EC50 =0.1mM), and Barium cbhoride (EC50 <50>= 10mM), and the reverse potential of the K concentration of the external solution is changed. After the injection of oocyte, the protein was found within 24 hours. In the future, the oocyte development system may have strong positive control. This study focuses on ATP dependence and the development index of ATP. The applicant is not aware of the use of R.I in this study.

项目成果

Y.Seko et.al: "Expression of mayor histocompatibility complex class I antigen in murine jentricular myocytes Difected with Coxsacleie virus B_3" Circ.Res. 67. 360-367 (1990)

Y.Seko 等人：“受柯萨克莱病毒 B_3 感染的小鼠心室肌细胞中主要组织相容性复合物 I 类抗原的表达”Circ.Res。

M.Kuroーo et.al.: "cDNA cloning of a myosin heavcy chain isoform in embryonic smooth mescle and its experession during jasculan depelopment and arterio sclerosis" J.Biol.Chem.

M.Kuroo 等人：“胚胎平滑肌中肌球蛋白重链亚型的 cDNA 克隆及其在 jasculan 发育和动脉硬化过程中的表达”J.Biol.Chem。