IPNVに対するニジマス抵抗性への分子生物学的アプロ-チ

虹鳟鱼 IPNV 抗性的分子生物学方法

• 批准号: 02806035
• 负责人: 岡本 信明
• 金额: $ 0.83万
• 依托单位: 東京水産大学
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1990
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1990 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-02806035/
• 关键词: ニジマス; インタ-フェロンβ; 分子クロ-ニング

ニジマス肝臓より常法に従ってDNAを抽出し、種々の制限酵素で切断し、アガロ-ス電気泳動法でゲルを作製した。ナイロンメンブレンにDNAを転写し,サザンブロット法でインタ-フェロンβのDNAの探索を行った。探索のために使用したDNAプロ-ブは,大阪大学,谷口維紹博士より分与を受けたヒトインタ-フェロンβのcDNAを含むTPIF319ー13のプラスミドを大腸菌DH5αを用いて増殖させ、それより調製したPstI〜BglI断片である。ハイブリダイゼ-ションの条件を検討したところ、4XSSC,60℃,オ-バ-ナイトでハイブリダイゼ-ションを行い、3XSSC,55℃,30分の洗浄がDNA検出に最も好条件であることが明らかになった。この条件で行ったところ、XbaIで約25kbに、EcoRIでは約7kbと約5kbの2本にヒトインタ-フェロンβと相同性を示すバンドを検出できた。そこで、low meltingアガロ-スを用い、XbaI断片約25kbのDNAを回収し,ベクタ-としてCharomid9ー28を、宿主として大腸菌DH5を用いて、genomic DNAライブラリ-を作製した。このとき得られたコロニ-数は2×10^5であった。このDNAライブラリ-からコロニ-ハイブリダイゼ-ション法によって、ヒトインタ-フェロンβのプロ-ブと相同性を示すコロニ-を釣り出すことに成功した。現在、この陽性シグナルを示したコロニ-を増殖させ、Charomidを増やして制限酵素地図を作製中である。ヒトやマウスのインタ-フェロンβ遺伝子との相同性を確かめ,釣り出したニジマスDNAが真にインタ-フェロンβである可能性が高い場合には、インタ-フェロンの産生を確認して,RTGー2細胞とIPNウイルスの系を使って、ウイルス増殖抑制効果を確かめる予定である。また、mRNAレベルでの発現とニジマスのIPN抵抗性との関係についても調べる予定である。

Crucial ニ ジ マ ス liver よ り method often に 従 っ て を DNA extraction し, kind of 々 の で cut し limited enzyme, ア ガ ロ - ス 気 swimming method で ゲ ル を cropping し た. ナ イ ロ ン メ ン ブ レ ン に DNA を planning write し, サ ザ ン ブ ロ ッ ト method で イ ン タ - フ ェ ロ ン beta の DNA の exploration line を っ た. Explore の た め に use し た DNA プ ロ - ブ は, Osaka university, Dr Taniguchi d salt よ り points with を by け た ヒ ト イ ン タ - フ ェ ロ ン beta の cDNA contains を む TPIF319 ー 13 の プ ラ ス ミ ド を coliform DH5 alpha を with い て raised colonization さ せ, そ れ よ り modulation し た PstI ~ BglI fragment で あ る. ハ イ ブ リ ダ イ ゼ - シ ョ ン の conditions を beg し 検 た と こ ろ, 4 XSSC, 60 ℃, オ バ - ナ イ ト で ハ イ ブ リ ダ イ ゼ - シ ョ ン を い, 3 XSSC, 55 ℃, 30 points の が DNA at 検 に も most good condition で あ る こ と が Ming ら か に な っ た. こ の line conditions で っ た と こ ろ, XbaI で about 25 KB に, EcoRI で は about 7 KB と about 5 KB の 2 this に ヒ ト イ ン タ - フ ェ ロ ン beta と identity を shown す バ ン ド を 検 out で き た. そ こ で, low melting ア ガ ロ - ス を い, XbaI を back to about 25 KB の DNA fragment 収 し, ベ ク タ - と し て Charomid9 ー 28 を, host と し て coliform DH5 を with い て, genomic DNA ラ イ ブ ラ リ - を cropping し た. Youdaoplaceholder0 と と gives the られたコロニ- number られたコロニ 2×10^5であった. こ の DNA ラ イ ブ ラ リ - か ら コ ロ ニ - ハ イ ブ リ ダ イ ゼ - シ ョ ン method に よ っ て, ヒ ト イ ン タ - フ ェ ロ ン beta の プ ロ - ブ と identity を shown す コ ロ ニ - を り fishing out す こ と に successful し た. Now, こ の positive シ グ ナ ル を shown し た コ ロ ニ - を raised colonization さ せ, Charomid を raised や し limitations て enzymes to 図 を cropping systems in で あ る. ヒ ト や マ ウ ス の イ ン タ - フ ェ ロ ン beta heritage 伝 son と の identity を か indeed め, fishing り out し た ニ ジ マ ス DNA が really に イ ン タ - フ ェ ロ ン beta で あ likely が る い occasions に は, イ ン タ - フ ェ ロ ン の produce を confirm し て, RTG ー 2 cells と IPN ウ イ ル ス の is を make っ て, ウ イ ル ス raised colonization inhibition of unseen fruit を か indeed め Youdaoplaceholder0 set である. ま た, mRNA レ ベ ル で の 発 now と ニ ジ マ ス の IPN resistance と の masato is に つ い て も adjustable べ る designated で あ る.