T.denticola 抗原遺伝子クロ-ンの解析と応用

T.denticola抗原基因克隆的分析及应用

• 批准号: 02670840
• 负责人: 安孫子 宜光
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Nihon University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1990
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1990 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-02670840/
• 关键词: 歯周病; トレポネ-マ デンティコ-ラ; 遺伝子工学; 遺伝子解析; DNA 診断; PCR法

T.denticolaは菌周病の重要な原因菌であるが高度の偏性気性嫌菌であり、通常の培養法により細菌叢の動態を検査することは因難である。T.denticola遺伝子バンクから、60kdal抗原タンパク質遺伝子のクロ-ニングを行い、さらにrunaway replicationプラスミドをベクタ-とした安定クロ-ンpMD303を得た。抗原タンパク質遺伝子の塩基配列解読のためにpMD303、2.9kbDNAの遺伝子地図を明らかにした。Kpnlーclal 1.75kbについてはpUC系deletion mutantサブクロ-ンDNAを作製しユニバ-サルprimerを、またClalーKpnI1.15kbDNAは伸展合成primerを用いて、dideoxy法により塩基配列の解読を行った。一方リコンビナント60kdal抗原タンパク質を精製し、エドマン分解法によりN末端およびC末端のアミノ酸配列を分析した。そして、その結果と解読済みのDNA塩基配列情報片ら推定されるアミノ酸配列とを比較検討した。その結果、N末端およびC末端のアミノ酸配列分析結果と一致する領域を特定することに成功した。そして60並kdal抗原タンパク質のcoding領域はClaIーKpnI1.15kbの上流からKpnIーClal1.75kbに向って存在することが判明した。そこで、特定した構造遺伝子中の塩基配列情報から上流および下流部分のoliganucleotide断片をPCR法用のDNA primerとしてDNA合成機により合成した。つぎに歯肉縁下プラ-クからDNAを抽用し、TaqIポリメラ-ゼを用いてPCR法により遺伝子増幅を行い、DNAハイブリダイゼ-ションにより検出を試みた。その結果、直接的には検出不能であった歯肉縁下プラ-クから採取した微量試料でもT.denticolaの検索が可能であった。以上の結果から、60kdal抗原タンパク質遺伝子を用いた、PCR法利用によるとDNA診断は歯肉縁下プラ-ク中の微量 T.denticolaを検出し本菌の初期感染を診断できることが示唆された。

T.denticola is an important cause of bacterial disease. It is highly biased and difficult to detect the dynamics of bacterial flora by common culture methods. T.denticola gene expression, 60kdal antigen expression. Antigen DNA sequence analysis pMD303, 2.9kb DNA sequence analysis Kpnl-clal 1.75kb DNA is used to prepare deletion mutant Kpnl-clal primer, Kpnl-clal 1.15kb DNA is used to stretch and synthesize primer, and the dimethoxy method is used to dissociate the deletion mutant Kpnl-clal primer. A 60kdal antigen was purified and analyzed by N-terminal and C-terminal acid alignment. The results of this study were compared with those of the previous study. The results of N-terminal and C-terminal acid alignment analysis were consistent with those of domain-specific acid alignment analysis. KpnI1.15kb and KpnIClal1.75kb in the coding domain of K60 and Kdal antigen. DNA primer for PCR and DNA synthesizer for DNA sequence information in the upstream and downstream parts of the DNA sequence DNA extraction, TaqI detection, PCR amplification, DNA detection The results, direct detection can not be found in the sample, take a trace of the sample, the detection of T.denticola can be found in the sample. The above results show that 60kdal antigen can be used to diagnose the initial infection of this bacterium, and PCR can be used to diagnose the initial infection of this bacterium.

项目成果

M. Hayakawa: "Gene cloning of a Treponema denticola antigen recognized by patient serum with periodontal diseases" Oral Microbiol. Immunol.

M. Hayakawa：“牙周病患者血清识别的齿垢密螺旋体抗原的基因克隆”口腔微生物。

Y. Abiko: "Identification of Treponema denticola in subgingival plaque with recombinant DNA probe using polymelase chain reaction"

Y. Abiko：“利用聚合酶链式反应，利用重组 DNA 探针鉴定龈下菌斑中的密螺旋体”