P.gingivalis gly-pro peptidase 遺伝子の解析と応用

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Porphyromonas gingivalis gly‐pro peptidase遺伝子クローンpSNllからEcoRV 2.9 kb挿入断片をT7,SP6プロモーターをもつpGEM‐5Zf(+)のLacプロモーター下流のEcoRV 挿入部位にサブクローニングした。IPTGの添加培養系によりgly‐pro peptidaseの酵素活性が約100倍高い遺伝子クローンpMD130を得ることに成功した。pMD130クローンを大量培養し、細胞抽出液を調製して一連の高速カラムクロマトグラフィによりgly‐pro peptidaseを精製し単一標品を得た。次に、精製リコンビナント酵素標品のN‐末端アミノ酸配列をエドマン分析法により決定した。このN‐末端アミノ酸配列は、P. gingivalis菌体の細胞抽出液から精製した75 kDa gly‐pro peptidaseのN‐末端アミノ酸配列とよく一致していた。さらに、pMD130 plasmid DNA を鋳型としてSP6 RNA polymeraseを用いてRNA probeの作製を試みた。その結果、P. gingivalis染色体DNAとhybridizeし、gly‐pro peptidase遺伝子の検出RNA probeとして有用であることが判明した。一方、塩基配列解読のために200‐300bずつdeletionしたサブクローンpMD131‐1〜pMD131-10を作製した。これら各クローンのgly‐pro peptidase酵素活性を測定したところ、pMD131‐1〜pMD131‐3は酵素活性が保持されていたがpMD131‐4〜pMD131‐10は、酵素活性を失っていた。そこで、pMD131‐3〜pMD131‐10の7クローンについてplasmid DNAを精製し、塩基配列の解読を試みた。現在のところ、約70%の塩基配列の解読が終了しており、その解読データから推測されるアミノ酸配列に、75kDa gly‐pro peptidaseのN‐末端アミノ酸配列と一致する領域が確認された。この結果、構造遺伝子の位置が明らかになり、また、open reading frameが推定できた。今後、全塩基配列の解読を行い、歯周病の病原因子としてのgly‐pro peptidaseの役割について分子遺伝学的研究を推進したい。