P.gingivalis gly-pro peptidase 遺伝子の解析と応用

牙龈卟啉单胞菌甘氨酸肽酶基因分析及应用

• 批准号: 04671134
• 负责人: 安孫子 宜光
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Nihon University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1992
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1992 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-04671134/
• 关键词: Porphyromonas gingivalis; Gene cloning; DNA sequence; Periodontal disease; Glycyl prolyl aminopeptidase

Porphyromonas gingivalis gly‐pro peptidase遺伝子クローンpSNllからEcoRV 2.9 kb挿入断片をT7,SP6プロモーターをもつpGEM‐5Zf(+)のLacプロモーター下流のEcoRV 挿入部位にサブクローニングした。IPTGの添加培養系によりgly‐pro peptidaseの酵素活性が約100倍高い遺伝子クローンpMD130を得ることに成功した。pMD130クローンを大量培養し、細胞抽出液を調製して一連の高速カラムクロマトグラフィによりgly‐pro peptidaseを精製し単一標品を得た。次に、精製リコンビナント酵素標品のN‐末端アミノ酸配列をエドマン分析法により決定した。このN‐末端アミノ酸配列は、P. gingivalis菌体の細胞抽出液から精製した75 kDa gly‐pro peptidaseのN‐末端アミノ酸配列とよく一致していた。さらに、pMD130 plasmid DNA を鋳型としてSP6 RNA polymeraseを用いてRNA probeの作製を試みた。その結果、P. gingivalis染色体DNAとhybridizeし、gly‐pro peptidase遺伝子の検出RNA probeとして有用であることが判明した。一方、塩基配列解読のために200‐300bずつdeletionしたサブクローンpMD131‐1〜pMD131-10を作製した。これら各クローンのgly‐pro peptidase酵素活性を測定したところ、pMD131‐1〜pMD131‐3は酵素活性が保持されていたがpMD131‐4〜pMD131‐10は、酵素活性を失っていた。そこで、pMD131‐3〜pMD131‐10の7クローンについてplasmid DNAを精製し、塩基配列の解読を試みた。現在のところ、約70%の塩基配列の解読が終了しており、その解読データから推測されるアミノ酸配列に、75kDa gly‐pro peptidaseのN‐末端アミノ酸配列と一致する領域が確認された。この結果、構造遺伝子の位置が明らかになり、また、open reading frameが推定できた。今後、全塩基配列の解読を行い、歯周病の病原因子としてのgly‐pro peptidaseの役割について分子遺伝学的研究を推進したい。

Porphyromonas gingivalis gly‐pro peptidase gene fragment T7,SP6 EcoRV 2.9 kb insertion fragment T7,SP6 EcoRV insertion fragment T7, SP 6 The enzyme activity of glypro peptidase in IPTG supplemented culture system was about 100-fold higher than that of pMD130. pMD130 was cultured in large quantities, and the cell extract was prepared and purified at high speed. The N-terminal amino acid alignment of the enzyme standard was determined by the method of secondary purification and purification. The N-terminal amino acid sequence of P. gingivalis cell extract was purified to 75 kDa gly-pro peptidase and the N-terminal amino acid sequence was identical. In addition, pMD130 plasmid DNA sequencing and SP6 RNA polymerase were used for RNA probe production. P. gingivalis chromosome DNA hybridization, glypro peptidase gene detection RNA probe detection A party, a base arrangement, a deletion of 200‐300b, a deletion of pMD131‐1 to pMD131-10. The glypro peptidase enzyme activity of each enzyme was measured. The enzyme activity of pMD131 - 1 ~ pMD131 - 3 was maintained. The enzyme activity of pMD131 - 4 ~ pMD 131 - 10 was lost. The pMD131 - 3 ~ pMD131 - 10 are the seven most important parts of DNA purification and DNA sequencing. At present, about 70% of the amino acid sequence is terminated, and the domain of 75kDa gly-pro peptidase N-terminal amino acid sequence is confirmed. The result, the position of the structural element, is clearly defined, open reading frame is inferred. In the future, the study of molecular genetics of the etiological factors of periodontal disease and the treatment of glypro peptidase will be promoted.