ヒトDNAミスマッチ修復機構の解明とその発がんへの関与

阐明人类DNA错配修复机制及其与癌发生的关系

• 批准号: 04152120
• 负责人: 岡崎 太郎
• 金额: $ 1.92万
• 依托单位: Nippon Medical School
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Cancer Research
• 财政年份: 1992
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1992 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-04152120/
• 关键词: DNAミスマッチ修復; 葉酸脱水素酵素; ゲルシフト法; DNA修復遺伝子; DNA修復蛋白質

ヒト葉酸脱水素酵素遺伝子の89塩基上流に存在するDNAミスマッチ修復蛋白質1(MRP1)遺伝子は、大腸菌のDNAミスマッチ修復遺伝子であるMutSとの相同性が高く、ミスマッチ部位を認識して、DNAミスマッチ修復の開始段階に必須な蛋白質をコードすると考えられる。今年度はMRP1蛋白質の精製とDNA結合特異性測定法の開発を行なった。精製過程におけるMRP1蛋白質の測定は、MRP1蛋白質のC末側29%とプロテインAとの融合蛋白質に対する抗体を用いたイムノブロットで行なった。メソトリキセート耐性HL-60細胞抽出液からヘパリン-セファロース、及びハイドロキシルアパタイトカラムクロマトグラフィーにより部分精製できた。バキュロウイルス発現系により大量に発現したところ、MRP1蛋白質は不溶性であったが、尿素、塩酸グアニジンにより可溶化できた。さらに、MRP1蛋白質C末側27%とマルトース結合蛋白質の融合蛋白質を大腸菌で発現すると、可溶性蛋白質として大量に発現された。現在、MRP1蛋白質の全域を発現する系を作製中である。MRP1蛋白質のDNA結合特異性を検討するために、二本鎖オリゴヌクレオチドを用いたゲルシフト法を開発した。メソトリキセート耐性HL-60細胞の抽出液とミスマッチを含む二本鎖オリゴヌクレオチドをインキュベートすると、DNAミスマッチに依存した遅れたバンドが見られた。当教室において遺伝子の単離されたMRP1蛋白質の研究は、分子レベルでの機構が解かっていないヒトDNAミスマッチ修復機構の解明のための有力な出発材料になると思われる。今後もMRP1蛋白質の精製とDNA結合の特異性の解析を続け、MRP1蛋白質の性状を明らかにし、ヒトDNAミスマッチ修復機構を解明したい。

DNA repair protein 1(MRP1) gene is present in the upstream of folate dehydratase gene 89. The identity of MutS gene in E. coli DNA repair gene is high, the site of DNA repair is recognized, and the protein essential for the initial stage of DNA repair is examined. This year, the purification of MRP1 protein and the development of DNA binding specificity assay were carried out. Determination of MRP1 protein in purification process: 29% of MRP1 protein at C-terminal side and 29% of MRP1 protein at C-terminal side. HL-60 cell extract is a highly sensitive and sensitive medium. The protein MRP1 is insoluble in urea and is soluble in water. 27% of MRP1 protein C terminal was found in E. coli, and soluble protein was found in large quantities. Now, the whole MRP1 protein is in the process of being produced. The DNA-binding specificity of MRP1 protein was investigated by means of a two-dimensional approach. The extract of HL-60 cells contains two kinds of DNA. When studying MRP1 protein in the classroom, the mechanism of DNA repair is studied. In the future, the purification of MRP1 protein and the specificity of DNA binding will be analyzed, and the characteristics of MRP1 protein will be clarified.