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イネ種子アリューロン細胞を用いた細胞特異的cDNAライブラリーの構築

利用水稻种子糊粉细胞构建细胞特异性cDNA文库

基本信息

批准号：
05760079
负责人：
増村威宏
金额：
$ 0.58万
依托单位：
Kyoto Prefectural University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1993
资助国家：
日本
起止时间：
1993 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-05760079/
关键词：
rice oryza sativa L.aleurone layer cDNA library glutaredoxin thioltransferase seed development tissue specific expression

项目摘要

水稲「日本晴」の登熟期種子三分の一粒を実体顕微鏡下で解体し、アリューロン層とデンプン性胚乳組織に分離した。それぞれの組織より細胞を回収し、全RNAを単離し、oligo(dT)の結合した粒子を用いて微量mRNAを精製した。mRNAよりoligo(dT) primerを用いてcDNAを合成し、末端にdG-tailを付加した後、制限酵素切断部位を末端に導入可能にデザインしたoligo(dT),oligo(dC)・primerを使用し、PCR法によってcDNAを増幅した。cDNAの末端を処理し、アダプターを連結し、大腸菌plasmidに組み込み、形質転換し、cDNAライブラリーを構築した。およそ1,000個の細胞から100万のcDNAクローンを含むライブラリーを作製できた。そのうち、アリューロン細胞特異的cDNAライブラリーより300bp以上の挿入配列を持つクローンをランダムに13クローン選び、ノーザンブロット法によってアリューロン細胞特異的に発現するクローンを選択し、塩基配列決定を行ったところ6種のクローンに分類できた。データバンクによるホモロジー検索の結果、その中の1つのクローン(RASC8)の推定アミノ酸配列が、大腸菌、酵母、ウシ、ブタ等で既に報告されている酸化還元酵素Glutaredoxinと非常に高い相同性を示した。このcDNAを大腸菌で発現させ酵素活性を測定したところ、Glutaredoxinであることが確認できた。Glutaredoxinが植物においても存在することを初めて示すことが出来た。イネGlutaredoxinは、登熟過程種子のアリューロン層に特異的に発現しており、デンプン性胚乳組織、葉および根では発現していない。このことからアリューロン組織に特異的な機能を持つ可能性がある。また、それ以外にライブラリー中での存在割合の高いcDNAもクローン化出来た。ここで構築した組織特異的cDNAライブラリーを用いることにより、本研究課題で目的としていた組織特異的に発現する遺伝子の単離、解析を非常に効率良く行えることが判った。

A third of the mature seeds of "Nipponbare" were separated under microscope, and the endosperm tissue was separated. All RNA is isolated from the cells, and oligo(dT) is purified from the cells. mRNA oligo(dT) primer is used to synthesize cDNA, add dG-tail at the end, restrict enzyme cleavage site, and introduce oligo (dT) primer. PCR is used to amplify cDNA. cDNA terminal processing, DNA sequencing, E. coli plasmid assembly, DNA sequencing More than 1,000 cells were produced from 1 million cDNA fragments. For cell specific cDNA sequences of more than 300bp, 13 different sequences were selected and 6 different sequences were determined by using the cDNA sequence method. The results of this study, including the putative acid sequence of RASC8, E. coli, yeast, yeast, etc., have been reported for the acid-reducing enzyme Glutaretoxin, which shows very high identity. The enzyme activity of E. coli was determined. Glutaretoxin was determined. Glutaredoxin is the first plant to exist. Glutaredoxins are produced specifically in the seed layer during maturation, and in the endosperm tissue, leaves, and roots. The possibility of maintaining a specific function of the tissue is discussed. There is a high level of cDNA cleavage in the genome. The purpose of this study is to construct tissue-specific cDNA fragments and to analyze tissue-specific cDNA fragments.