極微量組織由来cDNAライブラリーを用いたイネ受粉・受精時期特異的遺伝子の単離

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受粉・受精・胚発生時期について遺伝子発現制御機構の解明を目指し、人口光式植物育成装置内で、年間を通して受精・種子形成のプロセスが進行するイネの栽培条件を検討すると共に、花器官の極微量組織からイネの受粉・受精時期特異的なcDNAライブラリーの作製を試み、受粉・受精時期特異的に発現する遺伝子の単離を目的とした。イネ種子形成期の組織分化・器官形成の分子機構を明らかにする為に、これまでに登熟過程のイネ種子1/3粒由来の胚乳およびアリューロン層から微量組織特異的cDNAライブラリーを作製し、アリューロン層特異的に発現する遺伝子を効率良く単離した。本研究では、特定時期(開花後数時間など)の微量な組織を狙えば、効率良く目的の遺伝子を取得可能と考え、以下の実験計画を立てて研究を進めた。1)人口光式植物育成装置内で、年間を通じて常時、受精、種子形成のプロセスが進行するイネ(矮性イネ)を選抜し、栽培条件を確立した。2)イネ種子の重複受精、種子形成過程における細胞分化の状況を検討するため、胚乳細胞および胚芽におけるマーカータンパク質(貯蔵タンパク質、トリプシンインヒビターなど)に対する抗体を用い、共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡による形態観察を行った。3)イネ種子開花直前、直後、2時間後、6時間後、12時間後等の各時期のイネ種子(子房部分)より、組織切片を作製し、レーザーメスを用いて、卵細胞や極核部分の切り出しを行った。4)受粉・受精時期特異的に発現する遺伝子を単離するために、イネ種子cDNAライブラリーをスクリーニング用プローブを微小組織由来mRNAからcDNAを合成することにより調製した。