芳香族L-アミノ酸デカルボキシラーゼの構造と機能の解析

芳香族L-氨基酸脱羧酶的结构与功能分析

• 批准号: 05780446
• 负责人: 林 秀行
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: Osaka Medical College
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1993
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1993 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-05780446/
• 关键词: 芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ; ピリドキサールリン酸; シッフ塩基; 互変異構造; 脱プロトン化; ヒスチジン残基; アスパラギン酸残基; 芳香族アミノ酸アミノトランスフェラーゼ

ピリドキサール酵素の反応機構の一般化をめざし、大腸菌体内で大量に発現したラット肝芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ(AADC)の構造と機能を、研究の進んだアミノトランスフェラーゼと対比しつつ解析を行っている.本年度に得た知見は以下の通りである.1.AADCにおける補酵素の存在様式 AADCにおけるピリドキサルリン酸(PLP)の存在様式を分光学的に解析したところPLPはLys303とシッフ塩基を形成しエノールイミン型と呼ばれる非解離型の互変異構造をとっていることが判明した.同じ芳香族アミノ酸を基質とする大腸菌芳香族アミノ酸アミノトランスフェラーゼ(AAAT)においてもシッフ塩基の構造はエノールイミン型が有意に増加しており,ピリドキサール酵素においては基質特異性と補酵素の存在様式が密接に関連していることが示された2.AADCの反応機構 ピリドキサール酵素においてPLPが基質と速やかに結合するためにはPLP-Lysシッフ塩基はプロトン化されたケトエナミン型であるのが好都合である.AADCと基質ドーパや基質アナログとの反応の分光学的解析から,AADCに基質が結合するとPLP-Lysシッフ塩基はエノールイミン型からプロトン化ケトエナミン型へ変化することが示された.一方AAATではエノールイミン型と脱プロトン化ケトエナミン型の混在した状態であるが,基質結合に伴ってやはりプロトン化ケトエナミン型へと変化することが示された.このようにピリドキサール酵素では基質特異性や反応特異性によって補酵素の存在様式に差があるが,基質結合後はすべてプロトン化ケトエナミン型となり,反応機構を統一的に理解することが可能であることが判った.3.AADCの活性に関与する残基 基質や基質アナログのpH依存性ならびに化学修飾の結果より,基質のアミノ基からプロトンを奪う残基としてヒスチジンが考えられた.このヒスチジンとしてデカルボキシラーゼに共通して保存されているHis192とHis269が候補と考えられる.これらのヒスチジン残基をアラニンに置換したものは活性を完全に消失しており、更にHis192はAADCの吸収スペクトルを大きく変化させていた.このことから,His192が補酵素PLPの近傍にあって基質の結合と活性化,さらに補酵素の機能発現にかかわる重要な残基であることが示された.その他,Asp252,Asp271もAADCの活性発現に重要な残基として同定されており,今後その役割の解析を進める予定である.

ピ リ ド キ サ ー ル enzyme の の 応 authorities generalization を め ざ し, coliform body で large に 発 now し た ラ ッ ト liver aromatic ア ミ ノ acid デ カ ル ボ キ シ ラ ー ゼ (AADC) の の tectonic を と function, research into ん だ ア ミ ノ ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼ と than し seaborne つ つ parsing line を っ て い る. This year, に obtained た insights に the following <s:1> general た である.1.AADCにおける enzyme supplement <s:1> exists in form AADC に お け る ピ リ ド キ サ ル リ ン acid (PLP) の others type を points of optical analytical し に た と こ ろ PLP は Lys303 と シ ッ フ salt formed を し エ ノ ー ル イ ミ ン type と shout ば れ る un-ionized の - each different tectonic を と っ て い る こ と が.at し た. With じ aromatic ア ミ ノ acid を matrix と す る coliform aromatic ア ミ ノ acid ア ミ ノ ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼ (AAAT) に お い て も シ ッ フ salt base の tectonic は エ ノ ー ル イ ミ ン が intentionally に raised add し て お り, ピ リ ド キ サ ー ル enzyme に お い て は substrate specificity と others existed enzyme の filling type が contact に masato even し て い る こ と が shown さ れ Youdaoplaceholder0 2.AADC <s:1> anti-応 mechanism ピ リ ド キ サ ー ル enzyme に お い て PLP が matrix と speed や か に combining す る た め に は PLP - Lys シ ッ フ salt base は プ ロ ト ン change さ れ た ケ ト エ ナ ミ ン type で あ る の が good all match で あ る. AADC と matrix ド ー パ や matrix ア ナ ロ グ と の anti 応 の spectroscopy analytic か ら, AADC が に matrix combining す る と PLP - Lysシッフ base シッフ エノ エノ エノ エノ エノ エノ <s:1> <s:1> methylation ケトエナ <s:1> methylation へ する とが transformation する する とが とが shows された. Party AAAT で は エ ノ ー ル イ ミ ン type と プ off ロ ト ン change ケ ト エ ナ ミ ン type の mixed し た state で あ る が, matrix combining に with っ て や は り プ ロ ト ン change ケ ト エ ナ ミ ン type へ と variations change す る こ と が shown さ れ た. こ の よ う に ピ リ ド キ サ ー ル enzyme で は substrate specificity や anti 応 specificity に よ っ て repair enzyme の others type に difference exists が あ る が, matrix combination は す べ て プ ロ ト ン change ケ ト エ ナ ミ ン type と な り, を unified に 応 authorities understand す る こ と が may で あ る こ と が convicted っ た. 3. AADC の active に masato and す る residues PH dependency matrix や matrix ア ナ ロ グ の な ら び に chemically modified の results よ り, matrix の ア ミ ノ base か ら プ ロ ト ン を duo う residues と し て ヒ ス チ ジ ン が exam え ら れ た. こ の ヒ ス チ ジ ン と し て デ カ ル ボ キ シ ラ ー ゼ に common し て save さ れ て い る His192 と His269 が alternate と exam え ら れ る. こ れ ら の ヒ ス チ ジ ン residues を ア ラ ニ ン に replacement し た も の は active を に disappear completely し て お り, more に His192 は AADC の suction 収 ス ペ ク ト ル を big き く variations change さ せ て い た. こ の こ と か ら, His192 が repair enzyme PLP の nearly alongside に あ っ て matrix の と activeness, さ ら の に repair enzyme function 発 now に か か わ る heavy To な residues で あ る こ と が shown さ れ た. そ の him, Asp252, Asp271 も AADC の active 発 に now important な residues と し て with fixed さ れ て お り, future そ cut の analytic を の service into め る designated で あ る.

项目成果

Hideyuki Hayashi: "Escherichia coli Aromatic AminoAcid Aminotransferase: Characterization and Comparison with Aspartate Aminotransferase." Biochemistry. 32. 12229-12239 (1993)

Hideyuki Hayashi：“大肠杆菌芳香氨基酸转氨酶：特征及其与天冬氨酸转氨酶的比较。”

Masahiro Iwasaki: "Protonation State of the Active-Site Schiff Base of Aromatic Amino Acid Aminotransferase" J.Biochem.115. 150-155 (1994)

Masahiro Iwasaki：“芳香氨基酸氨基转移酶活性位点希夫碱的质子化状态”J.Biochem.115。