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酵母mRNAキャッピング酵素の機能部位に関する研究

酵母mRNA加帽酶功能位点的研究

基本信息

批准号：
05780465
负责人：
柴垣芳夫
金额：
$ 0.58万
依托单位：
Kitasato University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1993
资助国家：
日本
起止时间：
1993 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

本年度は、酵母キャッピング酵素alphaサブユニットの構造と機能を、遺伝子工学の手法を用いて明らかにすることを目的として研究し、以下の結果を得た。1. alphaサブユニットは「酵素-GMP」反応中間体(E-pG)を経由する2段階でキャッピング反応を触媒するが、E-pGにおけるGMP結合部位Lys-70の役割を調べるため、Lys-70をsite-directed mutagenesis法を用いて、HisおよびIleに置換した変異体を作成した。これを大腸菌を用いて発現させ、E-pG形成活性を調べた結果、His,Ileいずれの置換体もE-pG形成はみられなかった。この結果は、70番アミノ酸がLysであることの重要性を示している。2. alphaサブユニットの構造遺伝子CEGlに、HindIIIリンカーを用いてアミノ酸挿入を行い、大腸菌を用いて変異alphaサブユニットを発現させ、E-pG形成活性を調べた。その結果、10種類の変異体のうち、GMP結合部位近傍に挿入を行ったHinP184、alphaサブユニットの中央ややN末よりに挿入を行ったXba502、Dra534、C末端近くに挿入を行ったXho1189の4種類については活性は検出されなかった。従って、E-pG形成活性には少なくともこれら3つの領域が必要であることが示唆された。3. CEGlは、酵母の生育にとって必須の遺伝子であり、CEGlを破壊した細胞株(cegl)は生育することが出来ない。そこで、リンカー挿入変異体をcegl株にプラスミドとして導入し発現させ、変異タンパク質の発現に依存した生育が観察されるかどうか見ることによって、変異タンパク質が酵母内で機能するかどうか検討した。その結果、in viteoにおいてE-pG形成が見られた変異体は、すべて生育したが、E-pG形成の見られなかった4種類については生育しなかった。このことは、E-pG形成とalphaサブユニットの機能との間に強い相関関係があることを示すものである。

This year, the yeast enzyme alpha has been used to test the machine power of the machine, and the technology of engineering and learning has been used to understand the purpose of the study. The results are as follows. 1. The alpha enzyme-GMP reverse enzyme (E-pG) is made up of two segments, the catalyst, the E-pG, the GMP, the Lys-70, the Lys-70, the site-directed mutagenesis, the His, the Ile, and so on. The pathogens were detected with E-pG, the activity was detected by E-pG, and the E-pG was formed by setting the E-pG to form an active strain. The results show that the importance of Lys is very important in 70 times. 2. Alpha was used to make CEGl, HindIII was used to inject acid into the industry, bacteria were used to detect alpha, and E-pG was used to form activity. The results showed that the activity of Xba502, Dra534, and C-terminal in the center of the HinP184, alpha, Xho1189, and so on, was not detected in the first half of the experiment. It is necessary to show that it is necessary to use the necessary information to show that it is necessary for E-pG to become active. 3. The reproductive cycle of CEGl and Saccharomyces cerevisiae must be cloned, and the cell strain (cegl) of CEGl mutant must be reproduced. The cegl plant was inserted into the body, and the plant was detected. The dependency was detected. The fertility was detected. The yeast machinery was tested. According to the results of the experiment, in viteo was responsible for the formation of reproductive diseases, and the formation of reproductive diseases, such as pregnancy, pregnancy, and E-pG. The information system and the E-pG form the alpha information system. The machine will be able to display the information on the other side of the table.