相同組換えの中間体解離酵素RuvCエンドヌクレアーゼの解析

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相同組換えの中間体と考えられているHolliday構造は二分子の二重鎖DNAがそれぞれ相補鎖を交換してX字型構造となった構造をしている。この中間体がDNAの交差部位で切断されると組換え体が生じると考えられており、我々は、RuvCタンパク質はこの反応に関与するエンドヌクレアーゼであることを証明してきた。本研究では、RuvCエンドヌクレアーゼの作用機序を明かにすることを目的とし、合成オリゴヌクレオチドで作成したHolliday構造のモデル基質を用いて解析した。その結果以下のことを明かにした。○RuvCは、4本の単鎖DNAが互いに交差しX字型となった構造のジャンクションに特異的に結合し、Y字型DNAや通常の二重鎖DNAに対するアフィニティーは弱い。○RuvCは、X字型DNAのジャンクションに相同性がある場合のみ切断するが、相同性の有無は結合反応に影響しない。○切断反応にはMg^<++>などの2価の陽イオンを必要とするが、結合反応は陽イオンの要求性はない。○Y字型DNAは結合アフィニティーが弱いにもかかわらず、X字型DNAと同様に良く切断された。但し、この場合もY字型DNAのジャンクションに相同性が必要であった。以上のこと等から、RuvCエンドヌクレアーゼの作用機序について次のように提案した。RuvCのHollidayジャンクション対する結合と切断反応は、独立したモードである。相同性を持つ場合のみX字型及びY字型DNAが切断されるということから、合成Holliday構造の取り得る特殊なトポロジーの場合のみRuvCの基質となると考えられる。このことは、真のHollidayジャンクションの構造を理解するうえで重要なキ-となると思われる。