ハイドロキシアパタイト・カラムクロマトグラフィによる損壊DNAの精密法の検討

羟基磷灰石柱层析法精密检测受损DNA

基本信息

批准号：
05857048
负责人：
赤根敦
金额：
$ 0.58万
依托单位：
Kansai Medical University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1993
资助国家：
日本
起止时间：
1993 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

腐乱死体から採取したDNAは高度に分解しており、ポリメレース・チェイン・リアクション(PCR)法によるDNA増幅を阻害することが判明した。これは反応時のプライマーの結合や正確な複製を阻害するためであると考えられ、この損壊DNAを除去して残存している高分子量DNAのみから正確なPCR増幅を行う方法(精製法)を検討した。1つの方法としてアガロースゲル電気泳動やアガロースゲルビーズによるカラムクロマトグラフィについて検討したところ、高分子量DNAの残存している試料では増幅が可能となった。しかし損壊DNAの中には塩基部分が外れて1本鎖状となったものも含まれている可能性があり、それを除去してより確実なPCR増幅が可能となる、ハイドロキシルアパタイトを用いた精製法について検討した。ハイドロキシルアパタイトは、含有するカルシウム・イオンとDNA鎖中のリン酸とが結合することによりDNAを吸着させるが、その結合の強さはDNAの立体構造に依存し、1本鎖DNAは2本鎖DNAよりも結合が弱く、両者の分離が可能となる。ただし蛋白質も結合してしまうため、蛋白分解酵素で処理した試料(蛋白未除去)から直接DNAを回収するのには問題ががあったので、フェノール/クロロフォルム処理等でDNAを精製した試料を対象とした。一般に温度をあげると1本鎖DNAと2本鎖DNAの分離はより著明となると言われており、分子生物学実験法の教科書であるMolecular Cloning,A Laboratory Manualなどには加温する簡単な装置が紹介されているが、本研究ではより簡便な方法を考慮し、室温での分離の精度を検討した。しかし分離の程度は分別できるほど良くなく、加温法などに工夫する必要が認められた。今後さらに検討を重ねる予定である。

从衰减尸体中收集的DNA高度降解，发现通过聚合酶链反应（PCR）抑制DNA扩增。这被认为是由于抑制反应过程中引物的结合和准确复制，以及一种方法（纯化方法），用于去除受损的DNA并仅研究了仅从其余高分子量DNA中进行准确的PCR扩增。使用琼脂糖凝胶珠研究了一种方法，用于琼脂糖凝胶电泳和色谱柱色谱法，并且在剩余高分子量DNA的样品上进行了扩增。但是，有可能会损坏的DNA可能包含单链碱基部分，并研究了使用羟基磷灰石进行纯化方法，从而允许更可靠的PCR扩增。通过结合DNA链中包含的钙离子，羟基磷灰石吸附DNA，但结合的强度取决于DNA的三维结构，而单链DNA的结合比双链DNA弱，从而允许两者分离。但是，蛋白质也结合，并且直接从用蛋白酶处理的样品（未去除蛋白质）中恢复DNA存在问题，因此使用苯酚/氯仿处理纯化DNA的样品被使用。人们普遍说，当温度升高时，单链DNA和双链DNA的分离变得更加明显，并在分子克隆（一种实验室手册）中引入了简单的加热设备，这是一本分子生物学实验方法的教科书。在这项研究中，我们考虑了一种更简单的方法，并检查了在室温下分离的准确性。但是，分离程度不足以允许分离，并且人们认识到有必要设计一种加热方法。我们计划将来继续进一步考虑。