血小板インテグリンα_<11b>β_3の機能ドメインの同定-ヒト/マウスキメラインテグリンを用いたモノクローナル抗体のエピトープマップによる解析-

α_<11b>β_3インテグリンの機能ドメインの同定をモノクローナル抗体のエピトープマップによって行った。1、ヒト/マウスキメラα_<11b>の作製--B57BL/6マウス血小板よりα_<11b>cDNAを得た。ヒトα_<11b>とはアミノ酸レベルで約90%の相同性が認められた。このcDNAをもとにヒト/マウスキメラα_<11b>cDNAを作製し、ヒトβ_3cDNAとともにトランスフェクションによってCOS,293細胞に発現させた。2、モノクローナル抗体のエピトープマップ--マウス由来の抗原に対してマウス抗体が反応しないことを利用し、フローサイトメーターにてCOS・293細胞に発現させたキメラインテグリンとの反応性を調べた。α_<11b>β_3の複合体を認識し、リガンド結合を阻害するモノクローナル抗体(P2,2G12,4F10)は、α_<11b>N末端部(♯2-210)に反応することがわかった。従来より、α_<11b>上の2番目のEF hand構造(♯294-312)がリガンド結合部位といわれてきたが、それよりははるかにN末端側が重要であることが判明した。3、ヒトα_<11b>フラグメントによるエピトープマップ--ヒトα_<11b>フラグメントを大腸菌に発現させ、ウェスタンブロットによって抗α_<11b>抗体の認識部位を決定した。EDTA処理α_<11b>β_3のみを特異的認識する抗体(PMI-1,D33C,2J99)の多くは、α_<11b>H鎖C末端部位を認識する。このことは、EDTA処理によるα_<11b>β_3の立体構造の変化がこの部位で生じていることを示唆する。

α_<11b>β_3インテグリンの機能ドメインの同定をモノクローナル抗体のエピトープマップによって行った。1、ヒト/マウスキメラα_<11b>の作製--B57BL/6マウス血小板よりα_<11b>cDNAを得た。ヒトα_<11b>とはアミノ酸レベルで約90%の相同性が認められた。このcDNAをもとにヒト/マウスキメラα_<11b>cDNAを作製し、ヒトβ_3cDNAとともにトランスフェクションによってCOS,293細胞に発現させた。2、モノクローナル抗体のエピトープマップ--マウス由来の抗原に対してマウス抗体が反応しないことを利用し、フローサイトメーターにてCOS・293細胞に発現させたキメラインテグリンとの反応性を調べた。α_<11b>β_3の複合体を認識し、リガンド結合を阻害するモノクローナル抗体(P2,2G12,4F10)は、α_<11b>N末端部(♯2-210)に反応することがわかった。従来より、α_<11b>上の2番目のEF hand構造(♯294-312)がリガンド結合部位といわれてきたが、それよりははるかにN末端側が重要であることが判明した。3、ヒトα_<11b>フラグメントによるエピトープマップ--ヒトα_<11b>フラグメントを大腸菌に発現させ、ウェスタンブロットによって抗α_<11b>抗体の認識部位を決定した。EDTA処理α_<11b>β_3のみを特異的認識する抗体(PMI-1,D33C,2J99)の多くは、α_<11b>H鎖C末端部位を認識する。このことは、EDTA処理によるα_<11b>β_3の立体構造の変化がこの部位で生じていることを示唆する。