放射性同位元素を用いない悪性腫瘍のプロテアーゼ活性の測定

不使用放射性同位素测量恶性肿瘤中的蛋白酶活性

• 批准号: 06771984
• 负责人: 今井 徹
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: Hokkaido University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1994
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1994 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06771984/
• 关键词: V型コラーゲン; コラゲナーゼ; MMP

1.人唾液腺眼細胞株の培養、培養上清の採取およびその濃縮。2.MicroplateのアビジンコートおよびBSAによるブロッキング。3.Biotin-NHSによるV型コラーゲンのピチオン化。4.コラゲナーゼ活性の測定・・・1。(1)アビジンコートしたMicroplateにビオチン化したV型コラーゲンを添加し、incubate後に各wellを洗浄。(2)Microplateに濃縮した培養上清サンプルを添加し、決められたTime courseに従ってincubateする。(3)Incubateした培養上清を別のアビジンコートしたMicroplateに移し、アビジン-ペルオキシダーゼを添加しincubateする。(4)各wellをPBSで洗浄後、基質として4-クロロ-1-ナフトールを添加しIncubate後に、Microplate readerで及光度を測定。上記計画に従って研究を進めた結果、及光度に一定の規則性を欠いたため、以下の計画に従って培養上清のコラゲナーゼ活性を測定。5.コラゲナーゼ活性の測定・・・2。(1)V型コラーゲンに濃縮した培養上清サンプルを添加、決められたTime courseに従ってincubateした後にProtease inhibitorよって反応を停止し、サンプルを還元条件下で電気泳動する。(2)ニトロセルロース膜に転写しBSAでBlocking後に、免疫学的な手段を用いて発色。その結果、Time courseの短いケースに切断されたV型コラーゲンの断片が出現し、培養上清中にV型コラゲナーゼ活性の存在することが確認された。現在は、当初の計画通りMicroplateを用いて少量のコラーゲン基質で高感度にコラゲナーゼ活性を測定できるよう、コラーゲンのビオチン化、Time-course等を研究中である。

1. Culture the human salivary gland eye cell line, and collect and concentrate the culture supernatant. 2.Microplate のアビジンコートおよびBSA によるブロッキング. 3.Biotin-NHS V-shaped sterilization. 4. Determination of コラゲナーゼactivity・・・1. (1) Add the microplate to the V-shaped microplate and clean it after incubation. (2) Microplate is concentrated and the culture supernatant is added, and the time course is added and the time course is incubated. (3) Incubate the culture supernatant and add the incubate to the microplate and incubate the culture supernatant. (4) After each well was washed with PBS, the matrix was added with Incubate, and the Microplate reader was used and the photometry was measured. The results of the above-mentioned research plan, the regularity of the photometry and the determination of the activity of the culture supernatant of the following plan are described. 5. Determination of コラゲナーゼactivity・・・2. (1) V-type コラーゲンにconcentrated したculture supernatant サンプルをadded, decided められたTime courseに従ってincubateした后にProtease The inhibitor stops the reaction and the electrophoresis moves under the condition of the inhibitor. (2) ニトロセルロース片に転写しBSAでBlockingに、 immunological means を用いて発色.そのRESULT、Time Course's short-cut short-circuit V-type sterilization fragments appeared, and the presence of V-type glucocorticoid activity in the culture supernatant was confirmed by することが. Currently, the original plan was to use a high-sensitivity microplate using a small amount of のコラーゲン matrix.ーゼActivity measurement system, コラーゲンのビオチンオチン, etc. are under research.