IP3結合蛋白質の分子デザインによる細胞内IP3/Ca^<2+>シグナリングの解析

通过 IP3 结合蛋白的分子设计分析细胞内 IP3/Ca^<2+> 信号传导

• 批准号: 06780579
• 负责人: 宮脇 敦史
• 金额: $ 0.7万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1994
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1994 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06780579/
• 关键词: イノシトール3リン酸(IP3); Ca^<2+>カルシウム; GFP; 螢光エネルギー転移

1。IP3結合蛋白質の分子デザインマウス小脳タイプ(タイプI)IP3受容体cDNAよりN末端736アミノ酸をコードする部分をIP3インジケイタ-としてのIP3結合蛋白質に用いた。N末端にセリン残基、C末端にリジン残基を遺伝子工学的手法を用いて導入し、特異的蛍光ラベルを可能にした。N末端セリンを過ヨウ素酸で処理し、アルデヒド基を、C末端リジンにはヒドラジドができるため、それぞれ求電子、求核性の蛍光プローブをラベルできる。また米国カリフォルニア大学のTsien博士の研究室ではGFP(green-fluoresence-protein)を改変するプロジェクトを推進めている。GFP蛋白質は、何らcofactorを必要とせず蛍光を発し得る為、蛍光プローブの細胞内遺伝子導入を可能にする画期的なツールである。様々な改変GFP蛋白質は、異なる吸収、蛍光スペクトラムを示し、蛍光エネルギー転移を可能にする幾つかの組み合わせが見つかっている。我々は、これら改変GFP遺伝子をTsien博士から分与してもらい、IP3結合蛋白質の両末端に連結させた。これにより、IP3結合蛋白質の精製-蛍光ラベル-細胞内注入、という一連の操作の省略が期待できる。これら蛋白質を大量に発現するべくバキュロウイルス-昆虫細胞の発現系、大腸菌の発現系を確立し、数mg以上の蛋白質を回収した。2。IP3結合蛋白質の基本的特性インヴィトロ実験により、この蛋白質の基本的特性に関してデータをとった。IP3の結合でどの程度の構造変化が起こるのかをゲル濾過実験検討した。GFP連結蛋白質について、励起、蛍光の波長ピークを解析したが、IP3の有無で蛍光エネルギー転移の著明な変化はなかった。更に異なる改変蛋白質の連結を計画している。

1. IP3 binding protein molecular デ の ザ イ ン マ ウ ス small 脳 タ イ プ (タ イ プ I) IP3 by let body cDNA よ り N terminal 736 ア ミ ノ acid を コ ー ド す る part を IP3 イ ン ジ ケ イ タ - と し て の IP3 binding protein に with い た. N terminal に セ リ ン residues, C terminal に リ ジ ン residues を but 伝 sub engineering technique を with い て import し, specific 蛍 light ラ ベ ル を may に し た. N terminal セ リ ン を too ヨ ウ element acid で 処 し, ア ル デ ヒ ド を, C terminal リ ジ ン に は ヒ ド ラ ジ ド が で き る た め, そ れ ぞ れ electronic and nuclear sex の 蛍 light プ ロ ー ブ を ラ ベ ル で き る. ま た U.S. カ リ フ ォ ル ニ の ア university Dr Tsien の laboratory で は GFP (green fluoresence - protein) を change - す る プ ロ ジ ェ ク ト を propulsion め て い る. GFP protein は, what ら cofactor を necessary と せ ず 蛍 light を 発 し る as, 蛍 light プ ロ ー ブ の cells survived 伝 son import を may に す る painting period な ツ ー ル で あ る. Others 々 な change - GFP protein は, different な る 収, 蛍 light absorption ス ペ ク ト ラ ム を し, 蛍 light エ ネ ル ギ ー planning may move を に す る several つ か の group み close わ せ が see つ か っ て い る. I 々 は, こ れ ら change - traces of GFP 伝 son を Dr Tsien か ら points with し て も ら い, IP3 binding protein の struck end link に さ せ た. <s:1> れによ る, IP3-binding protein <s:1> refinement -蛍 light ラベ で - intracellular injection, と う う consecutive <s:1> operation <e:1> omitted が expectation で る る る. こ れ ら protein を a lot に 発 now す る べ く バ キ ュ ロ ウ イ ル ス - insect cell の 発 now, coliform の 発 now を established し, の protein を back more than a few mg 収 し た. 2 The basic characteristics of IP3-binding protein <s:1> are <s:1> ヴィトロ experiment によ and に related to <s:1> てデ and タをとった タをとった. IP3, in combination with the で <s:1> degree of <s:1> structural change が, starts a <s:1> る <s:1> をゲ をゲ をゲ filter experiment 検 to explore <s:1> た. GFP link protein に つ い て, wound up, 蛍 の light wavelength ピ ー ク を parsing し た が, IP3 の presence of で 蛍 light エ ネ ル ギ ー planning move の zhao Ming な variations change は な か っ た. More に different なる modified proteins <s:1> link を project て て る る.

项目成果

Tomoyasu Sugiyama: "Monoclonal antibodies distinctively recognizing the subtypes of inositol 1,4,5-trisphosphate receptor:Application to the studies on inflammatorv cells" FEBS Letters. 354. 149-154 (1994)

Tomoyasu Sugiyama：“独特识别肌醇 1,4,5-三磷酸受体亚型的单克隆抗体：在炎症细胞研究中的应用”FEBS Letters。

Maki Yamada: "The Calmodulin binding domain in mouse type 1 inositol 1,4,5-trisphosphate receptor" Biochemical J.(in press).

Maki Yamada：“小鼠 1 型肌醇 1,4,5-三磷酸受体中的钙调蛋白结合域”Biochemical J.（出版中）。

Miki Yamamoto-Hino: "Immunohistochemical study of inositol 1,4,5-trisphosphate receptor type 3 in rat central nervous system" NeuroReport. 6. 273-276 (1995)

Miki Yamamoto-Hino：“大鼠中枢神经系统中肌醇 1,4,5-三磷酸受体 3 型的免疫组织化学研究”NeuroReport。