IP3結合蛋白質の分子デザインによる細胞内IP3/Ca^<2+>シグナリングの解析

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1。IP3結合蛋白質の分子デザインマウス小脳タイプ(タイプI)IP3受容体cDNAよりN末端736アミノ酸をコードする部分をIP3インジケイタ-としてのIP3結合蛋白質に用いた。N末端にセリン残基、C末端にリジン残基を遺伝子工学的手法を用いて導入し、特異的蛍光ラベルを可能にした。N末端セリンを過ヨウ素酸で処理し、アルデヒド基を、C末端リジンにはヒドラジドができるため、それぞれ求電子、求核性の蛍光プローブをラベルできる。また米国カリフォルニア大学のTsien博士の研究室ではGFP(green-fluoresence-protein)を改変するプロジェクトを推進めている。GFP蛋白質は、何らcofactorを必要とせず蛍光を発し得る為、蛍光プローブの細胞内遺伝子導入を可能にする画期的なツールである。様々な改変GFP蛋白質は、異なる吸収、蛍光スペクトラムを示し、蛍光エネルギー転移を可能にする幾つかの組み合わせが見つかっている。我々は、これら改変GFP遺伝子をTsien博士から分与してもらい、IP3結合蛋白質の両末端に連結させた。これにより、IP3結合蛋白質の精製-蛍光ラベル-細胞内注入、という一連の操作の省略が期待できる。これら蛋白質を大量に発現するべくバキュロウイルス-昆虫細胞の発現系、大腸菌の発現系を確立し、数mg以上の蛋白質を回収した。2。IP3結合蛋白質の基本的特性インヴィトロ実験により、この蛋白質の基本的特性に関してデータをとった。IP3の結合でどの程度の構造変化が起こるのかをゲル濾過実験検討した。GFP連結蛋白質について、励起、蛍光の波長ピークを解析したが、IP3の有無で蛍光エネルギー転移の著明な変化はなかった。更に異なる改変蛋白質の連結を計画している。