The pursuit of both brightness and photostability in fluorescent protein technology

荧光蛋白技术对亮度和光稳定性的追求

• 批准号: 21H05041
• 负责人: 宮脇 敦史
• 金额: $ 105.91万
• 依托单位: Institute of Physical and Chemical Research
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (S)
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-07-05 至 2026-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21H05041/
• 关键词: バイオイメージング技術; 蛍光タンパク質; brightnes; photostability; 蛍光標識技術; brightness; 褪色; 光安定性; 細胞小器官; 超解像顕微鏡; 小胞体; ミトコンドリア

蛍光タンパク質の「明るさ」と「光安定性（褪色しにくさ）」の間にはトレードオフがあると考えられている。これまで多くの変異体が「明るさ」を追求して開発されてきたが、ほぼ全て「光安定性」を犠牲にした所産である。褪色は、対象を明るく標識して観る場合は心配ないが、導入蛍光分子の量に厳しい制限がある場合に深刻な問題となる。少コピー数の分子種をある時間連続して追跡する実験では、蛍光分子に高い「光安定性」が要求される。従来は量的にも「明るさ」偏重の傾向があり、導入蛍光タンパク質の発現制限の是非はあまり真剣に議論されてこなかった。昨今のゲノム編集技術を駆使することで、導入蛍光タンパク質の少コピー数発現制御が可能である。本研究は、「明るさ」対「光安定性」のトレードオフの実体を把握しながら、我々が最近に作製した新規蛍光タンパク質をベースに、質的に明るくかつ褪色しない蛍光標識技術を開発することを目的とする。研究代表者らは、タマクラゲから新規にクローニングした緑色蛍光タンパク質を元に改変を行い、優れた実用的な明るさ（モル吸光係数、蛍光量子収率、発色団形成スピード）を示しながら、ケーラー照明型蛍光顕微鏡観察（放射照度：~ 10 W/cm2）において全く褪色しない蛍光タンパク質StayGoldを作製することに成功した。StayGoldと超解像顕微鏡法（SIM）を組み合わせることにより、細胞小器官（ミトコンドリアおよび小胞体）の高速、長時間、高空間分解能の観察に成功した。たとえば、小胞体構造は高時空間分解能で観察すると振動運動していることが明らかにされているが、小胞体から細胞質へのカルシウムイオン放出時に小胞体の振動運動が抑制されるという現象を新たに発見した。

蛍 light タ ン パ ク qualitative の "Ming る さ" と "light stability (fade し に く さ)" between の に は ト レ ー ド オ フ が あ る と exam え ら れ て い る. こ れ ま で more く の - variant が "Ming る さ" を pursuit し て open 発 さ れ て き た が, ほ ぼ full て "light stability" を bloods に し た produced で あ る. Fade は, like を seaborne Ming る く logo し て 観 る occasions は heart with な い が, import 蛍 light amount of molecular の に 厳 し limitations い が あ る occasions に deep な problem と な る. Less コ ピ ー several の molecular species を あ る time even 続 し て tracing す る be 験 で は, high molecular に 蛍 light い "light stability" が requirements さ れ る. 従 to は quantity に も "Ming る さ" lay particular stress on の tendency が あ り, import 蛍 light タ ン パ ク qualitative の 発 limitations is の is は あ ま り really 剣 に comment さ れ て こ な か っ た. Compiling technology yesterday today の ゲ ノ ム を 駆 make す る こ と で, import 蛍 light タ ン パ ク less mass の コ ピ ー number 発 now suppression が may で あ る. This study は, "Ming る さ" moral "light stability" の ト レ ー ド オ フ の be body を grasp し な が ら, I 々 が し the recent に cropping た new rules 蛍 light タ ン パ ク qualitative を ベ ー ス に, qualitative に Ming る く か つ fade し な い 蛍 optical identification technology を open 発 す る こ と を purpose と す る. Research representatives ら は, タ マ ク ラ ゲ か ら new rules に ク ロ ー ニ ン グ し た 蛍 green light タ ン パ ク qualitative を yuan に change - line を い, superior れ た be used な Ming る さ (モ ル absorption coefficient, the rate of 蛍 light quantum 収 発 color 団 form ス ピ ー ド) を shown し な が ら, ケ ー ラ ー type lighting 蛍 light 顕 micromirror 観 examine (radiation intensity of illumination: ~ 10 W/cm2) に お い て く all faded し な い 蛍 light タ ン パ ク qualitative StayGold を cropping す る こ と に successful し た. StayGold と super resolution method (SIM) を group 顕 micro mirror み close わ せ る こ と に よ り, small cell organs (ミ ト コ ン ド リ ア お よ び small cell body) の high speed, long time, high space decomposition can の 観 examine に success し た. た と え ば, small cell body structure は high spatial decomposition can で す was 観 る と vibration motion し て い る こ と が Ming ら か に さ れ て い る が, small cell body か ら cytoplasm へ の カ ル シ ウ ム イ オ ン release に small cell body vibration motion が の inhibit さ れ る と い う phenomenon を new た に 発 see し た.