IP_3結合蛋白質の分子デザインによる細胞内IP_3/Ca^<2+>シグナリングの解析

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イノシトール三リン酸(IP3)は、細胞内セカンドメッセンジャーとして小胞体等、細胞内Ca2+プールからのCa2+動員を引き起こし、細胞外刺激に対する細胞内Ca2+動態調節に重要な役割を果たしている。IP3受容体は小胞体膜上で4量体を形成し、IP3が結合することによって開くCa2+チャンネルである。我々はIP3受容体の構造一機能相関を解析する過程で、IP3受容体単量体全長2749アミノ酸のうち、N末端側約数百アミノ酸部分がIP3結合に必要十分であることを見いだした。最近我々は、このN末端部分(IP3結合蛋白質)をcDNAから大量に調整する発現系を確立した(大腸菌、バキュロウイルス)。このIP3結合蛋白質が、IP3結合によってどのような構造変化をおこすのかをゲル濾過法、ショ糖密度勾配遠心法を用いて調べた。蛍光ラベルしたIP3結合蛋白質の構造変化を蛍光強度の変化で検出する技術を開発し、更に細胞内への導入によって細胞内IP3濃度をリアルタイムでモニターすることを計画している。GFP蛋白質は、何らcofactorを必要とせず蛍光を発し得る為、蛍光プローブの細胞内遺伝子導入を可能にする画期的なツールである。様々な改変GFP蛋白質をスクリーニングしたところ、異なる吸収、蛍光スペクトラムを示し、蛍光エネルギー転移を可能にする幾つかの組み合わせが見つかってきた。IP3結合蛋白質のN末端、C末端にGFP蛋白質を連結させたキメラ蛋白質を作製し、現在それらの、IP3指示薬としての機能評価を行っている。