分裂終期のタバコ培養細胞BY-2より単離した190-kDa MAPの研究

从末期烟草培养细胞 BY-2 中分离的 190 kDa MAP 的研究

• 批准号: 06740608
• 负责人: 安原 裕紀
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: Kansai University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1994
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1994 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06740608/
• 关键词: タバコ培養細胞BY-2; 微小管結合タンパク質(MAPs); アミノ酸シークエンス; 架橋構造

細胞周期を分裂終期に同調化したタバコ培養細胞BY-2より得たミニプロトプラストから微小管を調製し、この微小管から、300mM KCl処理によって、190-kDa MAPを含む粗抽出分画を得、これをFPLC-Mono Sカラムにより精製した。この精製した190-kDa MAPをウシの脳由来のMAPを含まない微小管と、インキュベートした後、固定、包埋し、その切片を電子顕微鏡観察したところ、微小管と微小管を架橋するおよそ10nmの構造が認められ、この構造が190-kDa MAPであると考えられた。また、190-kDa MAPは、Mono-Sカラムによる精製段階で、収率が、甚だしく減少したため、この精製190-kDa MAPを抗原とした抗体の作成は諦め、190-kDa MAPの部分的なアミノ酸配列の決定に重点を置いた。190-kDa MAPを 含む粗抽出分画をSDS-PAGEにかけたのち、PVDF膜にブロットしCBB染色を行い、目的のバンドを切り出して、アミノ酸シークエンサーにかけたところ、十分な量の蛋白を用いたにも関わらず、PTHアミノ酸の信号が得られず、190-kDa MAPのN末はブロックされているものと判断した。そこで190-kDa MAPを移したPVDF膜をブロテアーゼで処理し分解を試みた。6種類のブロテアーゼを検討したが、いずれも良好でなかったため、CNBrによる分解を行った。分解処理したものを再びSDS-PAGEにかけ、PVDF膜にブロットし、CBB染色をしたところ、分解処理の収率は低かったが、いくつかのバンドが認められた。これを、アミノ酸シークエンサーにかけたが、ペプチドの量が不十分であったため、PTHアミノ酸の信号が弱く、その配列を決定するには至っていない。現在、十分量のペプチドを用いてアミノ酸配列を決定する努力を継続している。

Cell cycle isoregulation at the terminal phase of cell division in cultured cells BY-2 was obtained by microtubule modulation, microtubule modulation, 300mM KCl treatment, 190-kDa MAP, crude extract, FPLC-Mono S purification. The purified 190-kDa MAP was obtained by electron microscopy from microtubule, microtubule and microtubule. 190-kDa MAP, Mono-S MAP, Mono-S MAP, Mono-S 190-SDS-PAGE analysis of kDa MAP with crude extract, PVDF membrane, CBB staining, target protein, PTH, acid signal, 190-kDa MAP, and N-terminal detection. 190-kDa PVDF membrane 6. SDS-PAGE, PVDF membrane, CBB staining, low resolution of decomposition treatment, low resolution of decomposition treatment For example, if the signal of PTH is weak, the signal of PTH is weak, and the sequence of PTH is determined. Now, ten percent of the selection process is used to determine the acid allocation.