分裂終期のタバコ培養細胞BY-2より単離した190-kDa MAPの研究

从末期烟草培养细胞 BY-2 中分离的 190 kDa MAP 的研究

• 批准号: 06740608
• 负责人: 安原 裕紀
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: Kansai University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1994
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1994 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06740608/
• 关键词: タバコ培養細胞BY-2; 微小管結合タンパク質(MAPs); アミノ酸シークエンス; 架橋構造

細胞周期を分裂終期に同調化したタバコ培養細胞BY-2より得たミニプロトプラストから微小管を調製し、この微小管から、300mM KCl処理によって、190-kDa MAPを含む粗抽出分画を得、これをFPLC-Mono Sカラムにより精製した。この精製した190-kDa MAPをウシの脳由来のMAPを含まない微小管と、インキュベートした後、固定、包埋し、その切片を電子顕微鏡観察したところ、微小管と微小管を架橋するおよそ10nmの構造が認められ、この構造が190-kDa MAPであると考えられた。また、190-kDa MAPは、Mono-Sカラムによる精製段階で、収率が、甚だしく減少したため、この精製190-kDa MAPを抗原とした抗体の作成は諦め、190-kDa MAPの部分的なアミノ酸配列の決定に重点を置いた。190-kDa MAPを 含む粗抽出分画をSDS-PAGEにかけたのち、PVDF膜にブロットしCBB染色を行い、目的のバンドを切り出して、アミノ酸シークエンサーにかけたところ、十分な量の蛋白を用いたにも関わらず、PTHアミノ酸の信号が得られず、190-kDa MAPのN末はブロックされているものと判断した。そこで190-kDa MAPを移したPVDF膜をブロテアーゼで処理し分解を試みた。6種類のブロテアーゼを検討したが、いずれも良好でなかったため、CNBrによる分解を行った。分解処理したものを再びSDS-PAGEにかけ、PVDF膜にブロットし、CBB染色をしたところ、分解処理の収率は低かったが、いくつかのバンドが認められた。これを、アミノ酸シークエンサーにかけたが、ペプチドの量が不十分であったため、PTHアミノ酸の信号が弱く、その配列を決定するには至っていない。現在、十分量のペプチドを用いてアミノ酸配列を決定する努力を継続している。

微管是从从烟草培养的细胞By-2获得的微型化合物制备的，该细胞周期同步与分割阶段同步，并用300 mm KCL处理通过300 mm KCL处理，从微管中获得了含有190 kDa MAP的粗萃取馏分，这是通过fplc-Mono s列纯化的。将此纯化的190 kDa图与不包含牛大脑中的地图的微管孵育，然后固定和嵌入，并通过电子显微镜观察了部分，并且观察到了微管和微管之间的大约10 nm交叉链接的结构，并观察到了这一结构，并且被认为是190-KDA MAP。此外，随着单声道列的纯化步骤，190 kDa图的产量显着降低，因此，由于放弃了抗原，使用纯化的190 kDa图生产抗体，并且重点是确定190-KDA映射的部分氨基酸序列。在含有190 kDa图的粗萃取部分进行SDS-PAGE进行SDS-PAGE时，将PVDF膜印迹并染色CBB，将目标带切除并应用于氨基酸序列。尽管使用了足够量的蛋白质，但仍未获得PTH氨基酸信号，并确定将190 kDa图的N端被阻断。因此，将带有190 kDa图的PVDF膜用Brotease处理以降解膜。研究了六种类型的布罗贝斯，但没有一个状态良好，因此CNBR进行了降解。分解处理再次接受SDS-PAGE，将其印迹到PVDF膜上，并用CBB染色，尽管分解处理的产量较低，但观察到了几个条带。它应用于氨基酸序列仪，但由于肽量不足，PTH氨基酸信号很弱，无法确定其序列。当前，努力正在继续使用足够量的肽来确定氨基酸序列。