ウイルスRNAによる都市生態系の衛生環境保全の監視手法に関する研究

1.DNAプローブ法の環境水への適用手法の開発標識した遺伝子断片を用いた特異的遺伝子の検出法であるDNAプローブ法を、環境水に含まれるウイルス検出に適用する方法について検討した。モデルウイルスとして、RNAファージQβを用い、それを標的とする遺伝子の特異的検出を目指した。Qβ遺伝子のPCR産物(190bp)を鋳型とし、標識したDNA断片を作成し、プローブとした。しかし、標識のシグナルがX線フィルム上で検出されるにはプローブが1000以上必要であり、1粒子に1コピーしか標的遺伝子を有しないウイルスについて高感度の検出をおこなうためには、シグナルの強度をより強いものに改良する必要があることがわかった。2.環境水からの特定遺伝子の検出1.で述べた理由により高感度検出は難しいので、作成したプローブを、メンブレン上にブロッティングした高濃度のMS2、T4、Qβの遺伝子にハイブリダイズさせ、X線フィルムに感光した。T4は検出されなかったが、MS2はQβ断片とホモロジーがあり、検出された。また、寒天培地上に形成されたQβプラックをメンブレン上に写し取り、プローブをハイブリダイズさせて検出可能であった。野生のウイルスの検出後の同定に用いることについては、可能であると考えられる。3.ウイルス遺伝子の都市生態系における挙動の解明プローブのシグナルが強くなる可能性があることから、水道水、生下水、下水処理水、加えて、減菌した液体培地のそれぞれについて、遺伝子を検出する際の、プローブ法の誤陽性について検討を行った。それぞれの試水を膜で濃縮した場合、通水量に応じてシグナルが大きくなることから、誤陽性を生じさせる物質が存在していることがわかった。都市生態系における遺伝子の挙動を調べるためには、遺伝子の絶対濃度を減少させずに試料を精製する手法の開発が不可欠である。

1.DNAプローブ法の環境水への適用手法の開発標識した遺伝子断片を用いた特異的遺伝子の検出法であるDNAプローブ法を、環境水に含まれるウイルス検出に適用する方法について検討した。モデルウイルスとして、RNAファージQβを用い、それを標的とする遺伝子の特異的検出を目指した。Qβ遺伝子のPCR産物(190bp)を鋳型とし、標識したDNA断片を作成し、プローブとした。しかし、標識のシグナルがX線フィルム上で検出されるにはプローブが1000以上必要であり、1粒子に1コピーしか標的遺伝子を有しないウイルスについて高感度の検出をおこなうためには、シグナルの強度をより強いものに改良する必要があることがわかった。2.環境水からの特定遺伝子の検出1.で述べた理由により高感度検出は難しいので、作成したプローブを、メンブレン上にブロッティングした高濃度のMS2、T4、Qβの遺伝子にハイブリダイズさせ、X線フィルムに感光した。T4は検出されなかったが、MS2はQβ断片とホモロジーがあり、検出された。また、寒天培地上に形成されたQβプラックをメンブレン上に写し取り、プローブをハイブリダイズさせて検出可能であった。野生のウイルスの検出後の同定に用いることについては、可能であると考えられる。3.ウイルス遺伝子の都市生態系における挙動の解明プローブのシグナルが強くなる可能性があることから、水道水、生下水、下水処理水、加えて、減菌した液体培地のそれぞれについて、遺伝子を検出する際の、プローブ法の誤陽性について検討を行った。それぞれの試水を膜で濃縮した場合、通水量に応じてシグナルが大きくなることから、誤陽性を生じさせる物質が存在していることがわかった。都市生態系における遺伝子の挙動を調べるためには、遺伝子の絶対濃度を減少させずに試料を精製する手法の開発が不可欠である。