クエン酸発酵性乳酸菌のクエン酸分解酵素遺伝子のクローニングと他の乳酸菌での発現

柠檬酸发酵乳酸菌柠檬酸降解酶基因的克隆及在其他乳酸菌中的表达

• 批准号: 06760235
• 负责人: 森田 英利
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: Azabu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1994
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1994 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06760235/
• 关键词: gene cloning; citrate lyase; citrate permease; lactococci; transformation

まず,Lactococcus lactis subsp.lactis biovar diacetylactis(L.diacetylactis)NIAI N-7が保有しているプラスミドpN7CPにコードされたクエン酸透過酵素(Cit-P)遺伝子を,エリストマイシン耐性(Em^r)ベクターpIL253を用いてクローニングした。Em^rでクエン酸代謝を示す(Cit^+)形質転換体KAK1はpN7CP由来の3.8-kb断片が挿入されており,他のEm^r/Cit^+形質転換体KAK7は2.0-kb断片の挿入されたpKAK7を有していた。受容菌はCit-P活性がなくクエン酸分解酵素(Cit-L)活性のみを有するが,KAK1とKAK7は共にCit-P活性を新たに示すようになることが見いだされた。一方,pKAK7を用いてCit^- lactococci5菌株を形質転換したところ,3菌株についてはEm^rであったが,Cit-P活性はほとんど示さなかった。これは,上記菌株にCit-L活性がないためクエン酸が分解されず,クエン酸を取り込むことができなかったものと推定された。これに対して,Cit^-L.lactis subsp.lactisLM0230とNIAI SINの形質転換体はCit^+を示し,Cit-P活性も確認された。本研究により,Cit^-L.lactisと分類されているものの中にはクエン酸代謝におけるCit-P遺伝子のみの欠損株(Cit-L遺伝子は有する)もあることが示された。また,pKAK1とpKAK7はクエン酸分解酵素をクローニングできる可能性のあるベクター由来のEco RI,Sac I,Sma IおよびSal I消化部位を有することが確認できた。さらに,L.diacetylactis NIAI DRC1021の染色体にコードされたCit-L遺伝子のクローニングを試みた。すなわち,pKAK7をベクターとし,制限酵素にはEco RIを,受容菌としてL.lactis NIAI 1061を用いた。その結果,選択培地上でEm^r/Cit^+を示す形質転換体を得ることができた。Cit-L遺伝子がクローニングされている可能性が示唆されたが,その性質はEmの選択圧がかけられているにもかかわらず、非常に不安定であった。繰り返し実験の結果も同様であった。Em^r/Cit^+形質転換体のCit-L活性が不安定となる理由について,今後,検討を行う必要がある。

In addition,Lactococcus lactis subsp.lactis biovar diacetylactis(L.diacetylactis)NIAI N-7 maintains the presence of pN7CP and Cit-P gene, which is resistant to acid (Em^r) and pIL253. Em^r/Cit^+ mutant KAK1 contains a 3.8-kb fragment from pN7 CP, and his Em^r/Cit^+ mutant KAK7 contains a 2.0-kb fragment from pKAK7. City-P activity of the host bacteria was detected by KAK1 and KAK7. City-P activity was detected by KAK1 and KAK7. One side,pKAK7, Cit^- lactococci5 strain, 3 strain,Cit-P activity,Cit-P activity. The city-L activity of the above strain is estimated to be higher than that of the original strain. For this reason,Cit^-L.lactis subsp. lactis LM0230 and NIAI SIN have been identified as Cit^+. In this study,Cit^-L.lactis was classified into two groups: Cit-L and Cit-L. lactis. pKAK1 and pKAK7 are the most likely sources of Eco RI,Sac I,Sma I and Sal I digestion sites. In addition,L.diacetylactis NIAI DRC1021 chromosome was tested by Cit-L gene. pKAK7 is used to limit the enzyme Eco RI and to contain L.lactis NIAI 1061. As a result, Em^r/Cit^+ is selected to show that the quality of the material is changed. Cit-L The result is the same. Em^r/Cit^+ The Cit-L activity of the substance is unstable. In the future, it is necessary to discuss it.