乳酸菌におけるクエン酸透過酵素およびクエン酸分解酵素遺伝子のクローニングと解析

Lactococcus lactis subsp.lactis biovar diacetylactis(L.diacetylactis)18-16およびNIAI N-7より,各種代謝機能欠損(ラクトース代謝能;Lac^-,タンパク質分解能;Prt^-,クエン酸代謝能;Cit^-)株を得て,それらを18-16由来のLac^-Prt^-Cit^+株(SY181),Lac^-Prt^-Cit^-株(SY184)およびNIAI N-7由来のLac^-Prt^-Cit^+(N7-16)とした.まず,エリスロマイシン耐性(Em^r)を有するベクターpIL253を用いてLactococcus lactis subsp.lactis NIAI 1061およびSY184の形質転換条件を検討した.受容菌の調製には0.75%のDL-スレオニン含有のRPMI1640液体培地を用いて培養し,6時間後に集菌した.その結果,NIAI1061においては,その形質転換頻度が非常に高く,10^5/mug(pIL253)レベルであったが,SY184については10^1/mug(pIL253)レベルであった.SY184の形質転換頻度がかなり低かったのは,その菌株作出の際,プラスミドDNAの複製阻害剤であるアクリジンオレンジによって処理した(それに対する耐性能を示した)ため,細胞壁などに何らかの変化が起こったことによるものと思われる.次に,N7-16よりクエン酸透過酵素をコードしたプラスミドDNA(pN7CP)を抽出・精製し,pIL253と同様に制限酵素Xba Iで消化した。ライゲーションを行い,まずそれを用いて形質転換頻度が高かったNIAN1061を形質転換した.Em^r形質転換体を選択し,それらの保有するプラスミドDNAを抽出・精製し,Xba Iで消化したところ,pIL253とpN7CP由来のフラグメントが確認された.その構築プラスミドDNAを用いてSY184を形質転換したが,Em^r形質転換体を得るには至らなかった.その理由は,この菌株における形質転換頻度に問題があると思われ,今後その形質転換頻度の改善あるいは別のCit^-株の作出が必要である.

Lactococcus lactis subsp.lactis biovar diacetylactis(L.diacetylactis)18-16およびNIAI N-7より,各種代謝機能欠損(ラクトース代謝能;Lac^-,タンパク質分解能;Prt^-,クエン酸代謝能;Cit^-)株を得て,それらを18-16由来のLac^-Prt^-Cit^+株(SY181),Lac^-Prt^-Cit^-株(SY184)およびNIAI N-7由来のLac^-Prt^-Cit^+(N7-16)とした.まず,エリスロマイシン耐性(Em^r)を有するベクターpIL253を用いてLactococcus lactis subsp.lactis NIAI 1061およびSY184の形質転換条件を検討した.受容菌の調製には0.75%のDL-スレオニン含有のRPMI1640液体培地を用いて培養し,6時間後に集菌した.その結果,NIAI1061においては,その形質転換頻度が非常に高く,10^5/mug(pIL253)レベルであったが,SY184については10^1/mug(pIL253)レベルであった.SY184の形質転換頻度がかなり低かったのは,その菌株作出の際,プラスミドDNAの複製阻害剤であるアクリジンオレンジによって処理した(それに対する耐性能を示した)ため,細胞壁などに何らかの変化が起こったことによるものと思われる.次に,N7-16よりクエン酸透過酵素をコードしたプラスミドDNA(pN7CP)を抽出・精製し,pIL253と同様に制限酵素Xba Iで消化した。ライゲーションを行い,まずそれを用いて形質転換頻度が高かったNIAN1061を形質転換した.Em^r形質転換体を選択し,それらの保有するプラスミドDNAを抽出・精製し,Xba Iで消化したところ,pIL253とpN7CP由来のフラグメントが確認された.その構築プラスミドDNAを用いてSY184を形質転換したが,Em^r形質転換体を得るには至らなかった.その理由は,この菌株における形質転換頻度に問題があると思われ,今後その形質転換頻度の改善あるいは別のCit^-株の作出が必要である.