カイコ幼虫個体を用いた脂肪酸シクロオキシゲナーゼのアイソザイムの大量発現と精製

蚕幼虫脂肪酸环氧合酶同工酶的大规模表达和纯化

• 批准号: 06770108
• 负责人: 鈴木 啓史
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: The University of Tokushima
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1994
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1994 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06770108/
• 关键词: アラキドン酸; シクロオキシゲナーゼ; プロスタグランジン; cDNA; バキュロウイルス; リコンビナント酵素; 抗炎症剤

脂肪酸シクロオキシゲナーゼのアイソザイム(シクロオキシゲナーゼ-2、COX-2)のリコンビナント酵素を得るために、マウス骨芽細胞様株(MC3T3-E1)から逆転写PCR法でクローニングしたCOX-2のcDNAを用いて、組換えバキュロウイルスを構築した。この組換えウイルスを感染させた昆虫細胞Bombyx moriを破砕して、その高速遠心上清に比活性約50nmol/2min/mg蛋白のリコンビナントCOX-2を得た。また、COX-2に特異的なアミノ酸配列の合成ペプチドを抗原としてポリクローナル抗体を作製した。ウエスタンブロット法デ調べると、この抗体はヒツジとマウスのCOX-2と免疫反応性を示すが、ヒツジのCOX-1とは反応しないCOX-2に特異的な抗体であった。この抗体を用いて、昆虫細胞中で発現させた酵素がCOX-2であることが免疫反応性の点でも確かめられた。次に,リコンビナントCOX-2とヒツジのCOX-1を用いて7種類の非ステロイド系抗炎症剤を含む阻害剤の効果を検討した。2つの酵素に対するIC50を比較すると、ETYA、flurbiprofen、BW755C、NDGAは両酵素を同程度阻害し、indomethacinはCOX-1をほぼ特異的に阻害した。NS-398はCOX-2に特異的であったが、COX-2のペルオキシダーゼ活性は阻害せず、オキシゲナーゼ活性のみを阻害した。aspirinのCOX-1に対するIC50は560μMであったが、COX-2ではaspirinはシクロオキシゲナーゼ活性を15-リポキシゲナーゼ活性に変換させて、アラキドン酸からプロスタグランジンではなく主として15-ヒドロペルオキシ誘導体が生成した。

The fatty acids were isolated from PCR, bone germ cells (MC3T3-E1), fatty acids, bone germ cells (MC3T3-E1), bone germ cells (MC3T3-E1), bone marrow cells, bone bud cells, bone The specific activity of Bombyx mori in the supernatant of the infected insect cells was about 50nmol/2min/mg protein, the specific activity of Cox-2 was detected. The synthesis of antigens, antigens, antibodies, antibodies, antigens, antigens, anti The antibodies were detected by Elisa, and the antibodies were detected by Cox-2 immunoreactivity. Cox-1 antibodies were detected by COX-2 specific antibodies. The antibody was used to detect the enzyme in the cell of the insect. The enzyme COX-2 was detected in the cells of the insect. For the second time, seven types of anti-inflammatory products have been used in Cox-2 and Cox-1, which are anti-inflammatory. 2. The enzyme activity was higher than that of IC50 enzyme inhibitor, ETYA, flurbiprofen, BW755C, NDGA enzyme inhibitor and indomethacin Cox-1 inhibitor. NS-398 COX-2 special products are active, active and active. Aspirin, Cox-1, aspiration, IC50, 560, M, COX-2, aspirin, active, active, sour, sour, sour

项目成果

Hiroshi Suzuki: "Site-directed mutagenesis analysis on the iron binding domain and the determinant for the substrate oxygenation site of porcine leukocyte arachidonate 12-lipoxygenase." Biochim.Biophys.Acta. 1210. 308-316 (1994)

Hiroshi Suzuki：“对铁结合域和猪白细胞花生四烯酸 12-脂氧合酶底物氧合位点​​的决定因素进行定点诱变分析。”

Hartmut Kuhn: "Oxidative modification of human lipoproteins by lipoxygenases of different positional specificities" Journal of Lipid Research. 35. 1749-1759 (1994)

Hartmut Kuhn：“不同位置特异性的脂氧合酶对人类脂蛋白的氧化修饰”脂质研究杂志。