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ブタ白血球アラキドン酸12-リポキシゲナーゼのX線結晶解析

猪白细胞花生四烯酸12-脂氧合酶的X射线晶体分析

基本信息

批准号：
07780541
负责人：
鈴木啓史
金额：
$ 0.58万
依托单位：
The University of Tokushima
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07780541/
关键词：
アラキドン酸リポシゲナーゼ結晶化リコンビナント酵素

项目摘要

ブタ白血球12-リポキシゲンナーゼの結晶化に必要な比活性の高い高純度の精製酵素を得るために酵素の精製法の改良を試みたが、従来の免疫親和性クロマトグラフィーを用いた精製段階の多い方法では比活性の向上は認められなかった。そこで12-リポキシゲンナーゼとグルタチオンS-転移酵素との融合蛋白を大腸菌で発現させたところ、グルタチオン親和性クロマトグラフィーを用いて1段階の精製でほぼ均一に酵素を精製することができた。しかし比活性は約2-3μmol/min/mg蛋白と従来の精製法で得られる標品と大差が無かったので、従来法で得られた精製酵素標品と融合蛋白の精製酵素標品の両方について結晶化を試みた。Hampton社のCrystal Screen II結晶化キットの50種類の緩衝液と沈殿剤を用いて、嫌気的条件下で4℃にて透析法で結晶化を行った。融合蛋白では結晶は認められなかったが、従来法で精製した12-リポキシゲンナーゼを1M硫酸アンモニウムに対して透析したもので微結晶を得た。精製酵素の蛋白濃度、硫酸アンモニウムの濃度とpHを変化させて最適の組み合わせを検索したところ、10mg/mlの蛋白濃度で0.9M硫酸アンモニウム、pH5.56-6.28の条件で微結晶が得られることがわかったが、X線結晶解析を行うには十分な大きさではなかった。上記の結晶化キットを用いてハンギングドロップ法で結晶化を試みると、1M硫酸アンモニウムを用いた場合のみに微結晶を認めたが透析法で得られた結晶より小さかった。現在よりよい結晶を得るべく検討を続けている。

The purification of white blood cells by 12-D fractionation is necessary for the crystallization of white blood cells. The purification of enzymes is carried out in high purity. The fusion protein of 12-amino acid sequence and S-transferase was produced in E. coli and purified in the first stage of purification. The specific activity is about 2-3μmol/min/mg protein. The purification method is used to obtain the purified enzyme standard. The purification method is used to obtain the purified enzyme standard. Hampton's Crystal Screen II Crystallization is carried out in 50 buffer solutions and dialysis methods at 4 ° C. The fusion protein was crystallized and purified by 12-mer sulfuric acid. Protein concentration of purified enzyme, concentration of sulfuric acid, pH change, optimum composition, protein concentration of 10mg/ml, 0.9 M sulfuric acid, pH 5.56 -6.28, microcrystallization, X-ray crystallization analysis, etc. The above crystallization method is used to obtain crystallization. Now, the crystal is in the middle of the crystal.