ヒト精液γ-glutamy transferase遺伝子の塩基配列の解析

人精液γ-谷氨酸转移酶基因碱基序列分析

• 批准号: 06770324
• 负责人: 郡司 啓文
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: Fukushima Medical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1994
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1994 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06770324/
• 关键词: Human; Semen; γ-Glutamyl transferase; Aminopeptidase N; Protein sequence

[目的]精液GGTのcDNAのクローニングを目標として、subunitのN-末端アミノ酸配列を分析し、更に、遺伝子ライブラリで該当した物質に対するモノクローナル抗体を用いてウエスタンブロティングを行った。その結果、精液GGTの生化学的性状について新たな知見が得られた。[材料・方法]精漿からの精液GGTの精製は、精液を3,700xGで遠心後、硫安分画、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過等により、非活性が約140U/mg proteinの精製GGTを得た。精液GGTをSDS-PAGE電気泳動後、セミドライシステムによりPVDF膜にブロットし、150kDa及び95kDaの試料バンドを切り取り、自動気相シークエンサー(Applied Biosystems社Model 476A)にアプライした。データ解析には、Applied Biosystems社 610A Data Analysis Systemを用いた。分析は3回行い、3回とも一致したものをN-末端アミノ酸配列として採用した。アミノ酸配列の検索には、国立遺伝学研究所のGenBankのデータベースを用いた。ウエスタンブロッティングには、抗CD13モノクローナル抗体(DAKO-CD13,WM-47,Dakopatts社製)を用いた。[結果及び考察]95kDaバンドのN-末端アミノ酸配列は3回の分析とも、HPLCのピークに十分な有意差が得られず、確定できなかった。従って、この試料バンドのN-末端にブロッキングがおこっている可能性が考えられた。一方、150kDaバンドのN-末端アミノ酸配列の分析は、3回とも同様に、N-末端から14個のアミノ酸残基が確定できた。検索の結果、既知の腎GGTとは全くホモロジーを認めなかったが、aminopeptidase N(APN)とSerine以外の配列が一致していた。APNは免疫学の分野で知られるCD13と同一物質である。そこで、精液GGTについて、抗CD13モノクローナル抗体を用いたウエスタンブロッティングを行った。その結果、150kDaバンドに一致して反応性が認められた。95kDaバンドについては反応性は認められなかった。以上のことから、精液GGTの150kDaバンドはAPNである可能性が極めて高いと考えられる。APNは基質特異性が緩く、多くのペプチドのN-末端からアミノ基を順に切断する作用があるので、g-glutamyl化合物の分解も触媒する。従って、我々がこれまでに用いていた精液GGTのアッセイ系ではGGTとAPNを区別できていない可能性かせ考えられる。また、精液GGTの95kDaバンドに関しては、APNのオリゴマー構造のサブユニットの解析により、APNの幾つかの崩壊産物に95kDaの分子量を持つものが報告されている。今後、これとの相同性の検討が必要である。

[Objective] To analyze the nucleotide sequence of GGT cDNA in semen and its subunit N-terminal amino acid sequence. The results, semen GGT biochemical traits, new knowledge and knowledge [Materials and Methods] GGT purification of seminal plasma, sperm concentration of 3, 700xG, sperm concentration of 3, sperm concentration of After SDS-PAGE electrophoresis of semen GGT, the sample sizes of PVDF membrane, 150kDa and 95kDa samples were cut off, and the sample sizes of GGT were automatically separated (Applied Biosystems Model 476A). Applied Biosystems 610A Data Analysis System. The analysis of the N-terminal acid sequence is carried out in three cycles. The National Institute of Genetic Sciences 'GenBank database is available for use in the study of acid alignment. The anti-CD13 antibody (DAKO-CD13,WM-47,Dakopatts) was used. [Results and Investigation]95kDa N-terminal amino acid alignment was analyzed by HPLC and determined by HPLC. The N-terminal part of the sample is divided into two parts: one part is the N-terminal part of the sample and the other part is the N-terminal part of the sample. Analysis of the N-terminal amino acid sequence of a single, 150kDa nucleotide identified three identical, N-terminal amino acid residues. The results of the search, known kidney GGT, are consistent with the allocation of aminopeptidase N(APN) and Serine. APN immunology is divided into two parts: CD13 and CD13. The anti-CD13 antibody is used to detect GGT in semen. As a result, the 150kDa protein was found to be highly reactive. 95kDa The possibility of the above is extremely high, and the sperm GGT is 150kDa. APN is a matrix specific inhibitor and a catalyst for the decomposition of g-glutamyl compounds. The difference between GGT and APN is the possibility of using GGT and APN. The molecular weight of GGT 95kDa in semen, APN 95 kDa in structure, APN 95kDa in breakdown product and APN 95kDa in structure are reported. In the future, it is necessary to discuss the same nature.