肺血管内皮細胞への心房性ナトリウム利尿ホルモン遺伝子導入の検討

心房钠尿激素基因转移至肺血管内皮细胞的检查

• 批准号: 06770419
• 负责人: 加藤 修一
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: Yamagata University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1994
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1994 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06770419/
• 关键词: HumanANP遺伝子; 遺伝子導入

1、Human ANP遺伝子を組み込んだ発現型ベクターの精製ヒト心臓cDNAライブラリーより、ANP遺伝子マップ(Nature,309:724,1984)より考察された適当なプライマー hANPs,5'-GATCTCTAGATGCTCCTTGACGACGCCAGC-3',hANPas,5'-GATCTCTAGAGTCCTCCCTGGCTGTTATCT-3'を用いて、Polymerace chain reaction(PCR)法でhumanANPcDNAを作製した。これをCytomegalovirus(CMV)プロモーターを有する発現型ベクター(pRc/CMV)に組み込み、宿主細胞(E.Coli)にトランスフォームし増殖させた後、精製した。2、持続型ANP発現細胞株樹立によるANP発現ベクターの評価精製されたhumanANP発現型ベクター(pRc-hANP)を、Chinese Hamster Ovary(CHO)細胞にカルシウムリン酸法によってトランスフェクションし、G418でクローンを選択した。得られた各クローンのANPmRNA発現及び蛋白合成能をそれぞれNorthern blot analysis,Radioimmunoassay法により評価した。(1)Northern blot analysis持続型ANP発現細胞の各クローンのTotal RNAをグアニジン-塩化セシウム法で抽出し、1、2%アガロースゲルで電気泳動後、ナイロンメンブレンにブロッテイングした。ハイブリダイゼイションはpRc-hANPを制限酵素処理によって得たANPcDNAをプローブとして、ランダムプライムラベリング法で行った。持続型ANP発現細胞株は対照(親株、及びTGFβ発現細胞株)に比べ、明らかなANPmRNA遺伝子発現が得られた。(2)Radioimmunoassay持続型ANP発現細胞の培養上清から、ANP蛋白をカラム抽出し、Radioimmunoassay kitで測定した。20-120pg/mlの濃度で定量可能であった。

1. Human ANP cDNA was prepared by Polymerace chain reaction(PCR) method. The results showed that: 1. Human ANP cDNA was prepared by PCR (Nature,309:724, 1984). This Cytomegalovirus(CMV) is a virus that develops in the host cell (E.Coli), and is purified in the host cell (pRc/CMV). 2. Human ANP developing cell line (pRc-hANP), Chinese Hamster Ovary(CHO) cell line and G418 cell line were selected for ANP development and purification. Northern blot analysis and radioimmunoassay were used to evaluate ANP mRNA expression and protein synthesis in various tissues. (1)Northern blot analysis of Total RNA in different species of ANP developing cells was carried out. The pRc-hANP gene is used to produce the ANP cDNA. The expression of ANP mRNA was detected in both parental and TGFβ-producing cell lines. (2)Radioimmunoassay was used to detect ANP protein expression in culture supernatant and Radioimmunoassay kit. The concentration of 20-120pg/ml is quantifiable.