肺血管内皮細胞への心房性ナトリウム利尿ホルモン遺伝子導入の検討

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1、Human ANP遺伝子を組み込んだ発現型ベクターの精製ヒト心臓cDNAライブラリーより、ANP遺伝子マップ(Nature,309:724,1984)より考察された適当なプライマー hANPs,5'-GATCTCTAGATGCTCCTTGACGACGCCAGC-3',hANPas,5'-GATCTCTAGAGTCCTCCCTGGCTGTTATCT-3'を用いて、Polymerace chain reaction(PCR)法でhumanANPcDNAを作製した。これをCytomegalovirus(CMV)プロモーターを有する発現型ベクター(pRc/CMV)に組み込み、宿主細胞(E.Coli)にトランスフォームし増殖させた後、精製した。2、持続型ANP発現細胞株樹立によるANP発現ベクターの評価精製されたhumanANP発現型ベクター(pRc-hANP)を、Chinese Hamster Ovary(CHO)細胞にカルシウムリン酸法によってトランスフェクションし、G418でクローンを選択した。得られた各クローンのANPmRNA発現及び蛋白合成能をそれぞれNorthern blot analysis,Radioimmunoassay法により評価した。(1)Northern blot analysis持続型ANP発現細胞の各クローンのTotal RNAをグアニジン-塩化セシウム法で抽出し、1、2%アガロースゲルで電気泳動後、ナイロンメンブレンにブロッテイングした。ハイブリダイゼイションはpRc-hANPを制限酵素処理によって得たANPcDNAをプローブとして、ランダムプライムラベリング法で行った。持続型ANP発現細胞株は対照(親株、及びTGFβ発現細胞株)に比べ、明らかなANPmRNA遺伝子発現が得られた。(2)Radioimmunoassay持続型ANP発現細胞の培養上清から、ANP蛋白をカラム抽出し、Radioimmunoassay kitで測定した。20-120pg/mlの濃度で定量可能であった。