Studies of Oligomer Interaction in Cation Pumps in Real Time

阳离子泵中低聚物相互作用的实时研究

基本信息

  • 批准号:
    07044049
  • 负责人:
  • 金额:
    $ 2.11万
  • 依托单位:
  • 依托单位国家:
    日本
  • 项目类别:
    Grant-in-Aid for international Scientific Research
  • 财政年份:
    1995
  • 资助国家:
    日本
  • 起止时间:
    1995 至 无数据
  • 项目状态:
    已结题

项目摘要

The fluorescent probe, (BIPM), was used to monitor Na^+ translocation coupled to the conversion of E1P to EP2 in pig kidney Na, K-ATPase. The addition of 10 muM ATP to BIPM-labeled Na, K-ATPase gave an increase in fluorescence intensity with an apparent rate of 137/s and the phosphorylation with an apparent rate of 119/s. These results show that the BIPM signal and phosphoenzyme formation have similar kinetics and that, consequently, the conversion of E1P to E2P is very fast. At physiological[ATP], Na^+ release from E2P is rate-limited by phosphorylation and/or the conformational transitions involving Na^+ deocclusion.When pig stomach membrane H^+, K^+-ATPase preparations were incubated with[gamma-^<32>P]ATP,Mg^<2+> and Ca^<2+>, ^<32>P were incorporated into Tyr and Ser residues in the alphachain of H^+, K^+-ATPase. The radioactivity incorporated was shown to turn over. Mild tosylphenylalanyl chloromethyl ketone-trypsin treatmentifollwed by a reverse-phase column chromatography gave th … More ree radio active peptide peaks. The first and the second peaks were assigned, respectively, to be the same amino-terminal phospho peptides, containing boty Tyr^<10>(^<32>P) and Tyr^7(^<32>P) and Tyr^<10>(^<32>P), both of which had been also obtained by the trypsin treatment of the preparations incubated with[gamma-^<32>P]ATP,Mg^<2+> and vanadate (Togawa K., Ishiguro T., Kaya S., Shimada A., Imagawa T., and Taniguchi K.(1995)J.Biol. Chem. 270,15475-15478). The third peak was also obtained after the trypsin treatement of partially purified H^+, K^+-ATPase preparations incubated with[gamma-^<32>P]ATP,Mg^<2+> and protein kinase-C + Ca^<2+> or protein kinase-A.Addition of endoproteinase ASP-N to each third peak fraction gave a major ^<32>P peptide peak as shown to be Asp^<21>-Met-Ala-Lys-Met-Ser(^<32>P)-Lys-Lys-Lys^<30> in the alpha-chain. These data and others indicate that amino-terminal domain of the alpha-chain of H^+, K^+-ATPase containing Tyr^7, Tyr^<10> and Ser^<27> is a hot spot for protein kinases dependent phosphorylation. The data also suggest participation of Ca^<2+> and cAMP in these phosphorylation reactions. Less
用荧光探针(BIPM)检测了猪肾Na,K-ATP酶中Na^+转运与E1 P向EP 2转化的偶联。在BIPM标记的Na,K-ATP酶中加入10 μ M ATP,荧光强度以137/s的表观速率增加,磷酸化速率以119/s的表观速率增加。这些结果表明,BIPM信号和磷酸酶形成具有相似的动力学,因此,E1 P转化为E2 P非常快。在生理[ATP]条件下,Na^+从E2 P释放的速率受到磷酸化和/或Na^+去封闭构象转变的限制,当猪胃膜H^+,K^+-ATP酶制备物与[γ-^<32>P]ATP、Mg^&lt;2+&gt;和Ca^&lt;2+&gt;孵育时,^<32>P被掺入H^+,K^+-ATP酶肽链的Tyr和Ser残基。掺入的放射性被证明是可以转化的。用温和的对甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲基酮-胰蛋白酶处理,经反相柱层析, ...更多信息 放射活性肽峰。第一个和第二个峰分别被指定为相同的氨基末端磷酸肽,含有Tyr^<10>(^<32>P)、Tyr ^7(^ P<32>)和Tyr^<10>(^<32>P),这两个峰也是通过胰蛋白酶处理与[γ-^<32>P]ATP、Mg^&lt;2+&gt;和钒酸盐一起孵育的制备物获得的(Togawa K.,石黑T卡亚S.,Shimada A.,Imagawa T.,和Taniguchi K.(1995)J. Biol. Chem. 270,15475 -15478)。用胰蛋白酶消化部分纯化的H^+,K^+-ATP酶制备物,再与[γ-<32>P]ATP、Mg^2+和蛋白激酶-C + Ca ^2+或蛋白激酶-A一起孵育,也可得到第三个峰。向每个第三个峰部分中加入内切蛋白酶ASP-N,得到一个主要的α-<32>P肽峰,即α-链中的Asp^<21>-Met-Ala-Lys-Met-Ser(α-<32>P)-Lys-Lys-Lys^<30>。这些数据和其他数据表明,含有Tyr ^7、Tyr^7和Ser^7的H^+,K^+-ATP酶α链的氨基端结构域<10><27>是蛋白激酶依赖性磷酸化的热点。这些数据还表明Ca^2+和cAMP参与了这些磷酸化反应。少

项目成果

期刊论文数量(4)
专著数量(0)
科研奖励数量(0)
会议论文数量(0)
专利数量(0)
J.P.Froerhic: "Kinetics of the Phosphoenzyme interconversion reaction in BIPM-labeled pig kiney Na, k-ATPase" Biophysical Journal. 70. 327 (1996)
J.P.Froerhic:“BIPM 标记的猪肾 Na、k-ATP 酶中磷酸酶互变反应的动力学”生物物理学杂志。
  • DOI:
  • 发表时间:
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    0
  • 作者:
  • 通讯作者:
K.Togawa: "Reversible Phosphorylation of boty Tyr^7 and Tyr^<10> in the α-chain of pig stomach H^+,K^+-ATPase by a membrane-found kinase and phosphatase." Journal of Biological Chemistry. 26. 15475-15478 (1995)
K. Tokawa:“通过膜发现的激酶和磷酸酶对猪胃 H^+,K^+-ATP 酶的 α 链中的 Tyr^7 和 Tyr^<10> 进行可逆磷酸化。” 26. 15475-15478 (1995)
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    0
  • 作者:
  • 通讯作者:
J.P.Froerhic: "Kinetics of the Phosphoenzyme interconversion reaction in BIPM-labeled pig kiney Na^+,K^+-ATPase." Biophysical Journal. 70. 327 (1996)
J.P.Froerhic:“BIPM 标记的猪肾 Na^ ,K^ -ATP 酶中磷酸酶相互转化反应的动力学。”
  • DOI:
  • 发表时间:
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    0
  • 作者:
  • 通讯作者:
K.Togawa: "Revresible Phosphorylation of boty Tyr7 and Tyr10 in the alpha-chain of pig stomach H^+, K^+-ATPase by a membrane-found kinase and phosphatase" Journal of Biological Chemistry. 26. 15475-15478 (1995)
K.Tokawa:“通过膜发现的激酶和磷酸酶对猪胃 H^ 、 K^ -ATP 酶的 α 链中的 Tyr7 和 Tyr10 进行可逆磷酸化”《生物化学杂志》。
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