破骨細胞に特異的に発現する遺伝子のクローニング

本研究は、破骨細胞に特異的に発現するmRNAをクローニングし、その塩基配列を決定することを目的として行なわれ、これまでにつぎの研究成果を得た。破骨細胞はマウス長管骨より分離する予定であったが、骨質が硬くハサミによる細切が困難だったため、19日齢鶏胚の長管骨を用いた。骨片からの破骨細胞の分離は、Tezukaらの方法(Biochem Biophys Res Commn 186: 911-, '92)に改良を加えて下記の順で行った。原法に従って骨片から得た破骨細胞を含む細胞浮遊液をメッシュサイズ25μmのふるいでろ過して小型の細胞を除き、メッシュ上に残った大型の細胞を20時間培養した後pronase E処理して破骨細胞以外の細胞を培養皿から除いた。酵素消化は細胞を光学顕微鏡で観察しながら行い、破骨細胞のみを培養面に残すようにした。このようにして、直径90mmの培養皿あたり約100個の破骨細胞を得た。今後はこれまでにストックした破骨細胞からtotal RNAを分離し、differential display法(Liang et al., Science, 257: 967-, '92)で破骨細胞に特異的に発現するmRNAをクローニングし、塩基配列の決定を行う。実験計画では、破骨細胞の対照として脾細胞を用いる予定であったが、文献的に原法では偽陽性率が高いことが指摘されているため、カルチトニン処理、副甲状腺ホルモン処理した破骨細胞を対照とすることにより破骨細胞の特異的機能に関連した遺伝子のクローニングを目指す予定である。

本研究は、破骨細胞に特異的に発現するmRNAをクローニングし、その塩基配列を決定することを目的として行なわれ、これまでにつぎの研究成果を得た。破骨細胞はマウス長管骨より分離する予定であったが、骨質が硬くハサミによる細切が困難だったため、19日齢鶏胚の長管骨を用いた。骨片からの破骨細胞の分離は、Tezukaらの方法(Biochem Biophys Res Commn 186: 911-, '92)に改良を加えて下記の順で行った。原法に従って骨片から得た破骨細胞を含む細胞浮遊液をメッシュサイズ25μmのふるいでろ過して小型の細胞を除き、メッシュ上に残った大型の細胞を20時間培養した後pronase E処理して破骨細胞以外の細胞を培養皿から除いた。酵素消化は細胞を光学顕微鏡で観察しながら行い、破骨細胞のみを培養面に残すようにした。このようにして、直径90mmの培養皿あたり約100個の破骨細胞を得た。今後はこれまでにストックした破骨細胞からtotal RNAを分離し、differential display法(Liang et al., Science, 257: 967-, '92)で破骨細胞に特異的に発現するmRNAをクローニングし、塩基配列の決定を行う。実験計画では、破骨細胞の対照として脾細胞を用いる予定であったが、文献的に原法では偽陽性率が高いことが指摘されているため、カルチトニン処理、副甲状腺ホルモン処理した破骨細胞を対照とすることにより破骨細胞の特異的機能に関連した遺伝子のクローニングを目指す予定である。